Abonnez-vous par e-mail.

    Saisissez votre adresse e-mail pour vous abonner et recevoir une notification de chaque nouvel article par email.

    Rejoignez 36 autres abonnés

Analyse par méthodes immunologiques

La spécificité analytique ou la réactivité croisée d’un immunodosage fournit une indication de la manière dont le test répond à d’autres molécules par rapport à la molécule utilisée comme étalon. Le profil de réactivité croisée de l’immunodosage est important pour évaluer s’il convient à une tâche particulière. Par exemple, la détermination de l’utilisation de la cocaïne par l’analyse d’un échantillon d’ urine nécessite que le dosage immunologique présente une bonne réactivité croisée avec le métabolite urinaire benzoylecgonine. En revanche, le test doit démontrer une bonne réactivité croisée avec la cocaïne si les échantillons à analyser sont des extraits de salive ou de cheveux, car des concentrations élevées du médicament parent par rapport aux métabolites sont trouvées dans ces échantillons.

Avec des immunodosages compétitifs classiques (tels que RIA et EIA), la réactivité croisée est souvent calculée par rapport à la quantité de médicament qui déplace 50% du réactif signal lié à l’anticorps. Dans le domaine des tests de médicaments, il est courant d’ajouter une quantité connue de médicament au test et d’enregistrer la réponse qui est donnée. Le pourcentage de réactivité croisée est ensuite calculé comme suit:

 

Par exemple, si dans un test d’opiacés (calibré avec des étalons de morphine) auquel une solution de 1000 ng / mL de codéine est ajoutée comme échantillon d’essai, le résultat du dosage lu par rapport à la courbe d’étalonnage de la morphine est de 100 ng / mL. la réactivité croisée de la codéine dans le dosage par rapport à la morphine est de 10%, c.-à-d.

Cependant, pour de nombreux dosages immunologiques, il n’est pas suffisant de tester les réactifs croisés à une concentration unique. Plusieurs concentrations doivent être préparées dans la matrice d’échantillon testée et l’effet sur l’essai doit être examiné, ce qui permet de réaliser un étalonnage ou une courbe d’étalonnage pour chaque réactif croisé potentiel.

Une réactivité croisée non parallèle peut être observée dans un groupe de médicaments pour le (s) médicament (s) parent et métabolite (s). Les formes isomères peuvent également présenter des profils de réactivité croisée différents et il est fréquent de voir une réactivité différente entre la (+) – amfétamine et la (-) – amfétamine.

Les médicaments testés pour la réactivité croisée indiquent à l’analyste quels composés pourraient être appropriés pour une analyse de confirmation ultérieure après un résultat d’immunodosage positif. Les médicaments qui montrent peu ou pas de réactivité croisée in vitropeuvent donner des résultats positifs de forte immunodosage des personnes qui prennent le médicament in vivo . Par exemple, la benzfétamine est convertie en métamfétamine et en amfétamine, mais la molécule mère ne présenterait pas de réactivité croisée dans de nombreux dosages immunologiques avec la métamfétamine ou l’amfétamine.

Le facteur important en ce qui concerne les anticorps du point de vue d’un analyste est de connaître les caractéristiques de l’anticorps utilisé dans l’immunodosage. La connaissance du type d’immunodosage utilisé est importante pour la prochaine étape du processus analytique, par exemple la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ( GC-MS ). Si un immunodosage est utilisé pour démontrer l’utilisation d’un médicament en mesurant ses métabolites dans l’urine, la méthode de confirmation doit être configurée de manière appropriée. Ceci peut être réalisé par l’introduction d’étapes d’hydrolyse de sorte que, par exemple, les métabolites de glucuronide, qui sont détectés par le criblage d’immunodosage, puissent ensuite être analysés en tant que composé de médicament parent par GC-MS .D’autres métabolites peuvent être ciblés, comme le métabolite de la buprénorphine norbuprénorphine, et la substance la plus appropriée pour être ciblée par GC-MS doit être prise en considération. Il est normal d’établir une limite inférieure pour l’analyse de confirmation que celle utilisée pour la méthode de sélection initiale.

Les caractéristiques de conception du test ci-dessus ont des conséquences importantes lors de l’utilisation du dosage immunologique pour des échantillons autres que l’urine (par exemple la salive, les cheveux et le sang). Par exemple, si le médicament dans l’échantillon est largement présent sous forme parentale dans la salive ou les cheveux, l’anticorps et le dosage immunologique doivent être dirigés vers la molécule parente plutôt que vers les métabolites.

Immuno-essais hétérogènes

Les immunodosages hétérogènes nécessitent la séparation de l’antigène lié et libre avant la mesure du signal. Cela est dû à l’absence de différence dans le signal généré par le médicament lié à l’anticorps ou le marqueur libre. L’étape de séparation des dosages hétérogènes donne deux avantages distincts par rapport aux dosages homogènes.Premièrement, l’interférence endogène potentielle de l’échantillon produit par le sang total ou l’urine fortement décolorée est éliminée au stade du lavage avant le développement du signal.Ceci a l’avantage que des étapes préliminaires d’extraction d’échantillons ne sont pas nécessaires. Deuxièmement, la réaction a des limites de détection inférieures à celles des dosages homogènes. Cette différence est illustrée par la possibilité d’utiliser directement du sang total dans un kit de test hétérogène, alors que l’extraction de l’échantillon sanguin est généralement nécessaire avant l’analyse en méthode homogène (Perrigo et Joynt 1995) et la détection de drogues puissantes comme le LSD ( Cassells et al., 1996, Kerrigan et Brooks, 1999). D’autres applications pour les dosages hétérogènes comprennent le criblage des cheveux et de la salive, dans lequel les concentrations de médicament sont significativement plus faibles que dans l’urine.

Bases d'un immunoessai.

Bases d’un immunoessai.

Immuno-essais enzymatiques

Les termes dosage immuno-enzymatique ( EIA ) et ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sont souvent utilisés de manière interchangeable pour décrire les dosages non isotopiques et, plus généralement, pour décrire des dosages hétérogènes et homogènes.

Dans le contexte de méthodes hétérogènes, EIA et ELISA ont largement remplacé le RIAcomme système de dosage en raison des avantages déjà soulignés. Les méthodes EIA sont basées sur la capture d’anticorps utilisant des systèmes d’antigènes marqués, tandis que les méthodes ELISA sont basées sur des anticorps marqués. Les deux types d’immunodosages sont des systèmes compétitifs.

Systèmes de capture d’anticorps

Le système utilise des anticorps anti-médicament déposés sur un puits de microplaque par absorption passive. Une microplaque est un plateau de 96 puits (chacun ayant un volume d’environ 400 ul) qui sont généralement disposés en bandes de 12 x 8 puits. Le revêtement peut être réalisé en ajoutant simplement une solution de l’antisérum ou de l’anticorps purifié dans un tampon bicarbonate à pH 9 en utilisant des pipettes de haute précision. Une période d’incubation appropriée (par exemple une nuit à température ambiante) permet aux anticorps de bien se lier à la microplaque en plastique. Après cette incubation, la solution est lavée de la phase solide et séchée pour laisser un puits recouvert d’anticorps. Dans certains cas, un enrobage secondaire d’une protéine non pertinente est effectué pour augmenter la stabilité de l’anticorps en phase solide et pour empêcher la NSB des composants du dosage dans le puits en plastique de la microplaque. Ce procédé fait partie du procédé de fabrication de réactifs de kits commerciaux fournis sous la forme d’une microplaque sèche avec l’anticorps pré-enrobé.

En exécutant le test, un échantillon (10 μL à 50 μL) est ajouté à la microplaque suivie d’une solution tamponnée (typiquement 100 μL) qui contient une quantité fixe de médicament marqué avec une enzyme telle que la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline. La plaque est ensuite laissée suffisamment longtemps pour permettre au médicament marqué à la peroxydase de raifort et à tout médicament présent dans l’échantillon d’entrer en compétition pour se lier à l’anticorps en phase solide. Ceci est appelé la période d’incubation. En l’absence de médicament, la liaison maximale du marqueur enzymatique se produit. Des quantités accrues de médicament dans l’échantillon entraînent une diminution des quantités de marqueur enzymatique lié aux anticorps. Après la période d’incubation, la microplaque est lavée avec un tampon approprié (l’étape de séparation) pour éliminer toute trace de marqueur enzymatique non lié. Le conjugué enzymatique lié à l’anticorps (et le médicament lié à l’anticorps) est laissé immobilisé sur la paroi de la microplaque revêtue d’anticorps.

Après l’étape de lavage, un réactif de substrat est ajouté au puits de la microplaque et laissé pour développer la couleur. Le substrat de choix pour la peroxydase de raifort est le peroxyde d’hydrogène dilué avec de la tétraméthylbenzidine ( TMB ) comme chromagène, qui est disponible sous la forme d’un produit prêt à l’emploi liquide-stable. Le TMB fournit un signal de couleur bleue qui peut être mesuré à 630 nm en utilisant un lecteur de microplaques de laboratoire standard. En utilisation de routine, le développement de la couleur est arrêté, après qu’il s’est développé sur une période d’incubation de 20 à 30 min, par l’addition d’acide sulfurique dilué 1 M. Cela provoque un décalage de l’absorbance qui est lu à 450 nm.L’ensemble du processus d’analyse décrit ici peut être entièrement automatisé ou effectué avec le plus simple des équipements de laboratoire.

La quantité de médicament marqué par une enzyme liée à l’anticorps en phase solide, et donc disponible pour le développement de la couleur, est inversement proportionnelle à la quantité de médicament dans l’échantillon. La couleur produite au stade final de l’ EIA est donc inversement proportionnelle à la quantité de médicament dans l’échantillon, ce qui donne une courbe d’étalonnage similaire à celle trouvée avec RIA .

Épreuve immuno-enzymatique, systèmes marqués par anticorps

Les procédures ELISA compétitives sont similaires à la microplaque EIA revêtue d’anticorps décrite ci-dessus. La différence est que l’anticorps anti-drogue est marqué enzymatique plutôt que le médicament. Un dérivé de médicament est appliqué sur le puits en plastique, ce qui permet de séparer les fractions liées et libres.

Le médicament est conjugué à une protéine en utilisant un processus similaire à celui utilisé pour préparer un immunogène. Il doit s’agir d’une protéine différente de celle utilisée comme protéine porteuse pour fabriquer l’anticorps afin d’empêcher la liaison des anticorps anti-protéines fabriqués au cours du processus d’immunisation. Le conjugué protéine-médicament peut être appliqué sur le puits de la microplaque de la même manière que pour le revêtement des anticorps dans l’ EIA (voir ci-dessus). Pendant le test, en utilisant des procédures similaires à celles décrites pour l’ EIA , la compétition se produit entre le médicament dans l’échantillon et le médicament immobilisé pour la liaison à un anticorps anti-médicament marqué par une enzyme. Après l’incubation, une étape de lavage est utilisée pour séparer les fractions liées et libres et laisser l’anticorps marqué immobilisé sur le dérivé de médicament en phase solide sur la paroi du puits de la microplaque. La quantité d’anticorps marqué qui est liée et responsable de la génération du signal est inversement proportionnelle à la concentration de médicament dans l’échantillon.

Le schéma de base pour un test ELISA. Notez le lavage entre les étapes. C'est la caractéristique distinctive d'un essai hétérogène.

Le schéma de base pour un test ELISA. Notez le lavage entre les étapes. C’est la caractéristique distinctive d’un essai hétérogène.
Le schéma montre un immunodosage en phase solide compétitif typique couramment utilisé pour détecter les drogues d'abus. C'est un format hétérogène utilisant des étapes de lavage pour éliminer les matériaux qui ne se lient pas immunologiquement. Le signal est inversement proportionnel à la concentration de médicament libre dans l'échantillon.

Le schéma montre un immunodosage en phase solide compétitif typique couramment utilisé pour détecter les drogues d’abus. C’est un format hétérogène utilisant des étapes de lavage pour éliminer les matériaux qui ne se lient pas immunologiquement. Le signal est inversement proportionnel à la concentration de médicament libre dans l’échantillon.

Radioimmunoassay

RIA était le précurseur des immunoessais hétérogènes. Les difficultés liées à la manipulation et au stockage de la radioactivité, à l’élimination des déchets radioactifs et à la demi-vie des Marqueurs radioactifs ont entraîné le remplacement de l’ AIR par des méthodes EIE non isotopiques.

Deux types principaux de RIA ont été utilisés pour tester les médicaments en fonction de l’isotope utilisé. Un Marqueur de médicament isotopique est appelé traceur. L’utilisation de tritium (3H) ou de médicament marqué au 14C permet une structure moléculaire identique du traceur au médicament testé, bien que le comptage des émissions bêta (β) implique un fluide de scintillation à base organique et un compteur à scintillation bêta sophistiqué. L’utilisation du 125 I émettant des rayons gamma comme traceur permet un comptage plus rapide et plus efficace et un certain nombre de RIA de recherche (Hand et al., 1986) et commerciaux ont été basés sur cet isotope.

Le principe des immunodosages pour l’ EIA est le même que pour l’ EIE décrit ci-dessus. Des tubes revêtus d’anticorps ont été utilisés avec de bons résultats avec des traceurs iodés. La décantation simple sépare facilement les fractions liées et libres, et permet la quantification de la fraction liée en utilisant un compteur gamma (γ). D’autres manières de séparer des fractions liées et libres comprennent l’utilisation d’une seconde étape de précipitation d’anticorps. Cela nécessite une centrifugeuse pour former une pastille de matériau lié qui peut être comptée après que la fraction libre a été décantée ou aspirée. Des billes magnétiques et d’autres particules revêtues d’un second anticorps ont également été utilisées pour faciliter cette séparation des fractions liées et libres. Le charbon enrobé de dextrane a été utilisé pour absorber le traceur libre de la solution et permettre ainsi de compter la fraction liée à l’anticorps dans le surnageant (Bartlett et al., 1980).

Immunoessais de chimiluminescence

La chimiluminescence offre un potentiel d’augmentation de la sensibilité d’un ordre de grandeur supérieur à celui de l’ AIR . Cependant, une telle sensibilité accrue aboutirait à des limites de détection bien supérieures à celles des techniques de confirmation actuelles et les tests de chimioluminescence n’ont donc pas gagné en popularité dans le dépistage de l’urine ou la toxicologie.

Le signal généré dans un immunodosage chimioluminescent est provoqué par des composés qui émettent de la lumière au cours d’une réaction chimique. Le flash de lumière peut être prolongé par l’ajout d’amplificateurs au système. L’augmentation de la luminescence, observée avec le luminol en présence de peroxydase de raifort et de phénols substitués, provoque une «lueur» prolongée de la lumière, plus facile à mesurer (Whitehead et al., 1983). Des substrats qui fournissent des extrémités chimiluminescentes pour d’autres marqueurs enzymatiques sont disponibles, tels que le phosphate d’adamantyl-dioxétane, tel qu’utilisé avec la phosphatase alcaline dans le système DPC Immulite (Hand 1994).

Marqueurs fluorescents

Les points d’extrémité fluorescents pour les immunodosages hétérogènes sont basés sur un marqueur fluorescent ou un fluorophore. Le principe de la fluorescence repose sur le «décalage de Stokes» ou mouvement de longueur d’onde de celui utilisé pour exciter le fluorophore à la longueur d’onde de détection à laquelle la lumière est émise par le fluorophore. Les marqueurs peuvent être utilisés dans un immunodosage de la même manière qu’un marqueur radioactif ou en utilisant un marqueur enzymatique pour générer une molécule fluorescente.

Un exemple de ce type de système de signal utilise un marqueur d’enzyme phosphatase alcaline et un substrat 4-méthylumbelliféryl phosphate. Le substrat est converti en la 4-méthylumbelliférone fluorescente, qui peut être détectée par un fluorimètre approprié. Lors de l’utilisation de la procédure de dosage décrite pour l’ EIA hétérogène ci-dessus, la fluorescence obtenue est inversement proportionnelle à la quantité de médicament dans l’échantillon.

L’utilisation de Marqueurs fluorescents dans les tests de toxicologie n’a pas acquis une grande popularité en raison de l’interférence des composants de l’échantillon endogène.

Méthodes d’écoulement latéral

Le secteur des immunodosages tend de plus en plus à développer des tests sur le lieu des soins. Le système Syva Emit (voir Méthodes homogènes) sur les petits analyseurs, tels que le système ETS, a permis de tester les médicaments en dehors du laboratoire pendant de nombreuses années (Centofanti 1994). L’utilisation de cartouches jetables simples ou bon marché et faciles à utiliser pour une variété de médicaments a accéléré cette tendance.

Les cartouches à usage unique sont essentiellement des variantes d’un test ELISA compétitif exécuté sur une bande en phase solide plutôt qu’à l’intérieur d’un puits ou d’un tube. Ces tests utilisent des particules comme moyen de génération de signal et sont principalement utilisés avec des anticorps qui ont été marqués avec de l’or colloïdal ou des sphères de latex colorées.Cette technique a été établie pour l’analyse des médicaments dans l’urine et peut également être appliquée sur du sérum, du sang total (en utilisant un filtre approprié pour séparer les globules rouges) et de la salive (en utilisant une méthode de collecte appropriée).

Comme avec ELISA , un dérivé antigène-protéine est fixé à une phase solide. Dans ce cas, il est lié à une membrane de nitrocellulose comme une ligne ou une série de points à une position définie. L’anticorps marqué (généralement marqué avec de l’or colloïdal ou du latex coloré) est situé dans un tampon qui chevauche la membrane de nitrocellulose.

Lorsque le tampon est humidifié avec l’échantillon, l’anticorps marqué réhydrate et s’écoule du tampon « indexant sur la membrane par capillarité. Lorsque l’échantillon et l’anticorps réhydraté marqué à l’or s’écoulent le long de la membrane, tout médicament dans l’échantillon se lie à l’anticorps marqué et l’empêche de se lier au médicament immobilisé sur la membrane. La séparation du médicament lié et libre continue, dans le cadre du processus de dosage, avec le mouvement du liquide à travers la membrane laissant soit la matière liée (une ligne visible) soit la matière libre pour se déplacer vers un tampon absorbant. Comme avec ELISA , la quantité de couleur développée (ou ligne formée sur le site du médicament immobilisé) est inversement proportionnelle à la quantité de médicament présente dans l’échantillon.

L’ajout d’une ligne de contrôle sur la membrane indique que suffisamment de liquide a traversé la longueur de la bandelette de test et indique ainsi que le test a été effectué correctement. Les lignées témoins utilisent typiquement des anticorps anti-IgG pour capturer l’excès d’anticorps marqué spécifique au médicament.

L’addition d’un certain nombre de lignées dérivées de médicament dans différentes positions sur la membrane de nitrocellulose avec des anticorps marqués appropriés correspondants permet l’analyse de plusieurs médicaments en même temps à partir d’un seul échantillon.

La majorité de ces tests sont interprétés visuellement, et les réactifs sont titrés et optimisés de telle sorte qu’il n’y ait pas de couleur ou de ligne quand la concentration «coupée» de l’analyte est présente. Les développements récents ont surmonté les problèmes d’interprétation visuelle associés aux essais d’écoulement latéral. Ceci a été réalisé en développant un petit lecteur portable basé sur l’imagerie numérique. Les avantages sont que la ligne peut être déterminée avec plus de précision, le résultat peut être quantifié si nécessaire et la subjectivité de l’interprétation visuelle est supprimée (Spiehler et al., 2000).

Immunoessais homogènes

Les immunodosages homogènes ne nécessitent pas la séparation des fractions liées et libres et, par conséquent, ont été automatisés avec succès dans un certain nombre de systèmes différents.

Le dosage immunologique le plus utilisé et le plus rentable utilisé pour cribler un grand nombre d’échantillons d’urine quand il n’y a pas besoin de haute sensibilité est l’ EIA homogène commercialisé par Syva (Dade-Behring) depuis de nombreuses années comme EMIT (technique immuno-enzymatique). Cette méthode, utilisée pour l’analyse de la morphine, a été publiée pour la première fois en 1972 (Rubenstein et al., 1972).

La technique EMIT est basée sur l’activité enzymatique d’une enzyme marquée au médicament, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ( PDH ), modulée par des anticorps dirigés contre le médicament. L’activité enzymatique (en présence de glucose-6-phosphate) entraîne la conversion de la nicotine adénine dinucléotide ( NAD ) en la forme réduite NADH et l’augmentation subséquente de l’absorbance à 340 nm est surveillée par spectrophotométrie.

L’addition de l’anticorps anti-médicament entraîne la liaison à l’enzyme marquée par le médicament, ce qui réduit efficacement l’activité enzymatique. Tout médicament dans l’échantillon entre en compétition avec l’enzyme marquée par le médicament en se liant à l’anticorps, ce qui permet à l’enzyme non liée de devenir active et augmente ainsi l’absorbance à 340 nm. Par conséquent, des quantités croissantes de médicament dans l’échantillon produisent une activité enzymatique accrue et donc une augmentation de la vitesse de variation de l’absorbance à 340 nm.

Système d'essai EMIT; le signal est directement proportionnel à la concentration de l'analyte.

Système d’essai EMIT; le signal est directement proportionnel à la concentration de l’analyte.

L’utilisation de la PDH bactérienne, qui utilise le NAD comme coenzyme, évite l’interférence de la PDH endogène, qui utilise le nicotine adénine dinucléotide phosphate ( NADP ). Des exemples antérieurs de la technique utilisaient le lysozyme (Rubenstein et al., 1972) ou la malate déshydrogénase (Ullman et Maggio 1980, Kabakoff et Greenwood 1981).

CEDIA, immunoessai de donneur d’enzyme cloné

Une variante plus récente du dosage immuno-enzymatique homogène est le système CEDIA.Ce système, comme EMIT, utilise la liaison d’un anticorps pour influencer l’activité d’une enzyme. La compétition pour la liaison par médicament présent dans l’échantillon entraîne une augmentation de l’activité enzymatique.

Le principe CEDIA (Henderson et al., 1986) repose sur la complémentation spontanée de deux fragments génétiquement modifiés de bêta-galactosidase d’Escherichia coli. La chaîne polypeptidique de l’enzyme est présentée sous forme de deux fragments inactifs, le grand fragment, appelé accepteur d’enzyme ( EA ), et un petit fragment, donneur d’enzyme ( ED ), qui contient les 5% d’enzyme manquants dans la partie EA . En conjuguant l’haptène au fragment ED , l’addition d’anticorps qui lient l’haptène peut empêcher la formation d’une enzyme intacte et donc active. Tout médicament présent dans l’échantillon entre en compétition pour des sites de liaison d’anticorps, de sorte qu’une augmentation des concentrations de médicament donne moins de liaison d’anticorps au fragment ED et résulte donc en plus d’activité enzymatique qui peut être surveillée par spectrophotométrie.

Immunoanalyse par polarisation de fluorescence

L’immunodosage par polarisation de fluorescence ( FPIA ) est un autre exemple d’immunodosage homogène et utilise l’antigène marqué à la fluorescéine comme molécule traceur (Dandliker et al., 1973). Il a été largement utilisé comme base de systèmes d’analyse pour analyser les médicaments dans l’urine (Colbert et al., 1985).

L’antigène marqué à la fluorescéine tourne rapidement lorsqu’il n’est pas lié par un anticorps.Lorsque lié par l’anticorps, la rotation est considérablement ralentie par rapport à la molécule non liée. Pour générer le signal de dosage, un fluorimètre fait briller la lumière, à la longueur d’onde d’excitation de la fluorescéine, à travers un filtre polarisant vertical. Les molécules de fluorescéine non liées et à rotation rapide émettent de la lumière dans un plan différent de la lumière incidente, tandis que la fluorescéine liée à l’anticorps relativement stationnaire renvoie la lumière dans un plan similaire, qui est détecté par le filtre polarisant.

Le médicament ajouté par l’intermédiaire de l’échantillon entre en compétition avec l’anticorps marqué à la fluorescéine, réduisant ainsi la quantité de fluorescéine liée à l’anticorps, ce qui entraîne la détection d’une moindre fluorescence émise par le biais du filtre polarisé. La fluorescence de fond trouvée avec de nombreux échantillons biologiques signifie qu’il est habituel de faire une lecture à blanc de l’échantillon et des réactifs avant l’addition du traceur fluorescent au mélange. Cette méthode est la base du système Abbott ADx.

Méthodes de microparticules

L’agglutination des microparticules a été utilisée comme système de signalisation dans des méthodes homogènes. Les réactions d’agglutination pour les médicaments utilisent des particules, généralement du latex, qui contiennent un médicament conjugué. L’addition d’anticorps (qui a deux sites de liaison) aux particules enrobées de médicament provoque un pontage entre les anticorps et les particules pour produire des agglutinats. Le médicament présent dans un échantillon, ajouté au mélange d’anticorps et de particules conjuguées à un médicament, entre en compétition pour les sites de liaison d’anticorps et empêche donc l’agglutination. Dans ce type d’essai, le degré d’agglutination est inversement proportionnel à la quantité de médicament dans l’échantillon.

La base du système Roche Abuscreen Online dénommé KIMS (interaction cinétique des microparticules en solution) consiste à surveiller la vitesse d’agglutination par des moyens spectrophotométriques.

Automatisation de l’immunoessai

La capacité d’un immuno-essai à analyser un grand nombre d’échantillons a conduit au développement d’un certain nombre de solutions automatisées différentes. Ceux-ci peuvent être adaptés pour répondre aux exigences des laboratoires utilisant des systèmes semi-automatisés jusqu’à l’automatisation complète avec capacité de marche. L’automatisation d’une séquence de dosage hétérogène jusqu’à l’étape de séparation est appelée « front-end », tandis que ces étapes post-séparation sont appelées « back-end ». L’automatisation complète de toutes les étapes nécessite un système capable de réaliser l’étape de séparation. L’automatisation frontale implique un mécanisme de pipetage précis pour les échantillons et les réactifs. Ceci est réalisé en utilisant un processeur d’échantillons robotisé qui facilite le transfert automatique d’échantillons (avec reconnaissance de code à barres) des tubes primaires aux puits de réaction (ou tubes). Ce transfert peut être effectué en mode batch (tous les échantillons sont pipettés d’une destination à l’autre) ou par accès aléatoire (transfert sélectif de l’échantillon vers un ou plusieurs puits de réaction différents) et peut être lu directement à partir d’une liste de travail importée .

L’échantillonnage peut être effectué en utilisant des pointes de pipettes jetables ou une sonde fixe revêtue de polytétrafluoroéthylène ( PTFE ) couplée à une commande de seringue de haute précision. L’utilisation de pointes de pipette jetables supprime la possibilité de transfert, tandis que les instruments à sonde fixe nécessitent un lavage intensif pour réduire le transfert (voir Dépannage, plus loin). Comme cela augmente les temps de traitement, plusieurs instruments de sonde ont été développés pour augmenter le débit.

L’automatisation back-end peut également utiliser des pipettes pour les réactifs (par exemple, le substrat) et, comme pour les systèmes frontaux, avoir la possibilité de chronométrer les étapes d’incubation et de maintenir des températures élevées si nécessaire. Les deux systèmes nécessitent un mécanisme qui permet d’exécuter plusieurs lots en même temps. Les systèmes dorsaux comprennent également un lecteur et un logiciel approprié pour la réduction des données, et peuvent être interfacés avec des ordinateurs centraux de laboratoire.

L’automatisation complète est essentiellement une combinaison de systèmes frontaux et dorsaux intégrant un mécanisme approprié pour achever la phase de séparation. Pour les microplaques, il s’agit d’une simple laveuse «embarquée» qui distribue automatiquement et aspire le liquide de lavage. Des systèmes similaires ont été développés pour le lavage de tubes, bien que la contrainte de taille signifie que ce sont des modules autonomes. Le processus d’automatisation des immunodosages enzymatiques hétérogènes est bien développé et est largement utilisé dans les laboratoires de banques de sang dans lesquels des milliers de tests peuvent être traités par jour. L’automatisation des dosages homogènes est moins complexe car ils ne nécessitent pas d’étape de séparation. Les systèmes les plus largement utilisés, tels que les méthodes EMIT, CEDIA et OnLine, sont facilement automatisés sur les analyseurs de chimie clinique modernes. Ces analyseurs sont capables de pipetter avec précision, de contrôler la température et de mesurer les taux d’absorption. Le débit de l’instrument peut aller de cent à mille tests par heure.

Analyse d’échantillons alternatifs à l’urine

Des dosages immunologiques pour les médicaments ont été largement utilisés dans l’analyse des échantillons d’urine. D’autres matrices d’échantillons, telles que le sang total, le sérum, les extraits de cheveux, la salive et la sueur, peuvent être utilisées avec succès. Les dosages hétérogènes sont idéalement adaptés à ces matrices alternatives. Leur sensibilité inhérente fournit les limites inférieures de détection exigées pour l’usage médico-légal et l’étape de lavage permet de traiter des effets matriciels difficiles. Une sélection correcte des anticorps permet de cibler le système de dosage sur des médicaments ou des métabolites spécifiques.

Les immunodosages sont généralement conçus pour un usage particulier et un type d’échantillon. Avec les tests de drogues, le test est souvent conçu pour des échantillons d’urine, alors que les dosages de médicaments thérapeutiques sont généralement conçus pour le plasma ou le sérum. Des situations peuvent survenir dans lesquelles le médicament d’intérêt est dans une matrice différente de celle pour laquelle le kit a été validé, il incombe donc à l’utilisateur de tester et de valider cette nouvelle application. Des trousses de dosage immunologique d’urine et de sérum sont largement disponibles et des dosages pour d’autres matrices, comprenant le sang, le liquide céphalorachidien, les ongles, les cheveux, le méconium, la salive, le contenu stomacal et la sueur, ont été développés avec succès.

De nombreux tests peuvent être adaptés pour travailler avec différentes matrices, bien qu’il soit conseillé de consulter le fabricant du kit avant de faire des adaptations de kit. Après discussion et conseil du développeur ou du fabricant d’un test, l’étape suivante consiste à obtenir des échantillons similaires au cas de test; Il est essentiel d’essayer de les faire correspondre aussi étroitement que possible, en particulier en ce qui concerne le type de conservateur utilisé.Certains échantillons (par exemple la bière en bouteille) sont facilement disponibles et il devrait être possible d’obtenir la marque exacte à tester, de sorte que l’alcool et les autres ingrédients soient identiques. Dans les cas tels que le sang total putréfié vieilli, pour obtenir et sélectionner une matrice d’échantillon peut s’avérer plus difficile

Une fois qu’une matrice d’échantillon appropriée a été obtenue, des quantités connues du médicament d’intérêt sont ajoutées à la matrice de l’échantillon. Les concentrations sont habituellement choisies pour tomber dans la gamme du kit. La grande sensibilité des immunoessais signifie qu’il est souvent possible d’introduire un facteur de dilution sans compromettre la limite de détection dans l’échantillon. Par exemple, si la limite de détection de la méthode de confirmation est de 100 μg / L, l’utilisation d’un EIA avec un seuil de 10 μg / L permet l’utilisation d’un facteur de dilution 1:10. Une telle dilution réduit les interférences potentielles sans compromettre la sensibilité globale.

Les immunodosages hétérogènes sont plus robustes et tolérants pour différents types de matrices d’échantillons que les dosages homogènes en raison de l’étape de séparation du test.

Une constatation courante, souvent décrite comme un «effet de matrice», est que la nouvelle courbe d’étalonnage n’est pas utilisable par interférence négative. Cela peut provenir d’une interférence inhérente de l’échantillon lui-même avec le système de signal ou de l’interférence avec la réaction anticorps-antigène. Les immunodosages homogènes sont plus sujets aux interférences puisque l’échantillon est présent pendant la phase de génération du signal.Réduire la charge d’échantillon par dilution dans un tampon approprié ou utiliser un volume d’essai plus petit devrait réduire l’effet. Malheureusement, le compromis est que la limite de détection et la forme de la courbe pourraient être sacrifiées. L’extraction en phase liquide ou solide de l’échantillon peut être utilisée lorsque l’application directe de l’échantillon échoue.

Contrôle qualité, étalonnage, standardisation et ajustement de courbe

Il est courant d’effectuer des immunodosages en laboratoire sous la forme d’un lot ou d’une série unique contenant du matériel d’étalonnage et de contrôle ainsi que des échantillons inconnus. A partir des calibrateurs (ou standards), une courbe d’étalonnage peut être dérivée et une concentration pour l’échantillon inconnu peut être déterminée. L’inclusion d’échantillons avec une concentration de médicament connue (témoins) à intervalles réguliers permet une évaluation de la reproductibilité dans le lot. La duplication et le contrôle de la reproductibilité constituent la base de l’évaluation de précision «in run».

L’inclusion du même matériel de contrôle de la qualité dans les essais consécutifs donne une indication de la reproductibilité entre les essais. Ceci peut être complété par l’inclusion d’échantillons de patients ou d’échantillons préalablement analysés. Conjointement avec les paramètres de la courbe de surveillance, ces composants permettent de se former une opinion quant à l’acceptabilité de la précision d’un lot à l’autre par rapport à des paramètres prédéfinis.

Les immunodosages médicamenteux peuvent être exécutés de plusieurs manières, en fonction des besoins des utilisateurs. Le dépistage des médicaments dans l’urine peut nécessiter un simple résultat qualitatif (positif ou négatif). Des résultats entièrement quantitatifs sont requis à des fins de diagnostic ou de TDM . Dans les applications médico-légales, une analyse en mode semi-quantitatif (avec un petit nombre de calibrateurs) fournit une estimation de la concentration. Cette concentration estimée est utile lors de la progression vers une étape de confirmation (par exemple GC-MS ).

Pour les dosages quantitatifs, l’ajustement de la courbe entre les points de données est important et un certain nombre d’options d’ajustement de courbe sont disponibles. Certains fabricants fournissent des programmes d’ajustement de courbe «fermés» qui déterminent l’ajustement, et les plages d’étalonnage sont fixées sur tous les instruments de cette marque particulière. Les systèmes ouverts permettent à l’utilisateur de sélectionner un ajustement et une transformation appropriés pour l’application particulière. Il faut faire attention à cette sélection, car il est possible de ne pas adapter l’ajustement de la courbe et l’immunodosage. Les problèmes courants comprennent les systèmes automatisés qui tentent d’ajuster une ligne droite à une courbe ou qui n’adaptent pas correctement les points d’une courbe. Il n’y a pas de substitut à l’opérateur vérifiant les données brutes d’un test.

Pour l’analyse toxicologique, il est souvent approprié d’utiliser un ajustement de courbe point à point (tout en acceptant que la courbe, loin d’un point, soit moins précise). D’autres exemples d’ajustements de courbe comprennent des ajustements de spline et de quatre paramètres. La considération primordiale est de s’assurer, en validant la méthode, que l’ajustement choisi connecte les points de données de la manière la plus appropriée. Un exemple simple de la façon dont le même test peut produire des résultats différents en raison du traitement des données est montré sur la figure 9. Les deux courbes sont tracées en utilisant les mêmes résultats, mais dans la série 1, des points d’étalonnage supplémentaires sont tracés. Les courbes tracées pour la série 2 fonctionnent de manière parfaitement satisfaisante en tant que test semi-quantitatif, mais donnent des résultats numériques inexacts aux points où l’ajustement de la courbe point-à-point n’est pas approprié pour fournir une réponse quantitative (illustrée au mieux à la Fig. la région de 100 μg / L). L’introduction de calibrateurs supplémentaires fournit une courbe plus robuste plus adaptée à la quantification de la concentration de médicament.L’ajout de calibrateurs supplémentaires garantit également qu’un seul point du calibrateur ne biaisera pas indûment la courbe. Sur la figure 9, en utilisant la série 2, une petite erreur ou un changement du calibrateur de 200 μg / L modifie significativement la courbe, mais avec la série 1, la courbe est maintenue par le point du calibrateur de 100 μg / L.

Exemple illustrant comment différents programmes d'ajustement de courbe peuvent influencer les résultats d'un immunodosage.

Exemple illustrant comment différents programmes d’ajustement de courbe peuvent influencer les résultats d’un immunodosage.

Dépannage

Des problèmes peuvent et vont surgir dans tous les tests d’immunodosage, qu’il s’agisse de méthodes développées en interne ou de tests commerciaux. Il est hors de la portée de cette section de couvrir le dépannage de toutes les méthodes car leur diversité est trop vaste. Il peut être nécessaire d’entreprendre une série d’expériences pour établir la cause du problème. Cela dépend en grande partie de la nature du problème, mais la règle d’or est de changer une variable à la fois. Cela permet d’économiser du temps et des réactifs.

Lorsque le problème a été corrigé, les détails de l’enquête doivent être consignés dans un dossier technique pour chaque méthode d’immunodosage. Idéalement, ce fichier devrait être lancé à l’étape du développement ou de la validation de la méthode.

Figure. 10 propose une approche de dépannage. À l’exception d’un échec complet du test, qui résulte généralement d’une erreur grossière, la plupart des problèmes nécessitent une analyse minutieuse et détaillée. Cela implique de comparer les performances médiocres actuelles d’un test par rapport aux données antérieures. Le matériel de référence historique peut prendre la forme de données accumulées lors de la validation ou du développement de la méthode, des données de contrôle de qualité interne et externe et éventuellement d’analyses d’échantillons qualifiés (par exemple ceux ayant un statut GC-MS connu).

En évaluant cette information, il devrait être possible d’établir si une trousse ou une méthode d’analyse fonctionne à l’extérieur des paramètres établis et d’obtenir un aperçu de la cause et, en fin de compte, de résoudre le problème. En définissant le problème, la plupart des questions peuvent être classées sous les rubriques d’imprécision à l’intérieur du dosage, d’imprécision de lot à lot et de performance d’évaluation externe de la qualité.

Organigramme pour aider à résoudre les problèmes rencontrés avec les immunodosages.

Organigramme pour aider à résoudre les problèmes rencontrés avec les immunodosages.

Imprécision intra-dosage

Tous les immunodosages ont une imprécision inhérente et pour cette raison, il a été pratique courante d’effectuer des analyses répétées. Pour un immunodosage particulier, l’accord entre les réplicats est une caractéristique constante qui peut être évaluée pour chaque test. Une mauvaise réplication est facilement identifiable et est souvent associée à un motif. Les laboratoires qui analysent uniquement les singletons n’ont pas ce système d’alerte précoce.

Un certain nombre de facteurs peuvent provoquer une imprécision intra-essai et il est bon d’utiliser des régimes de tests préventifs plutôt que de rechercher des problèmes curatifs après l’événement. Des problèmes avec le pipetage d’échantillons et de réactifs sont courants. Outre une mauvaise technique de pipetage, des problèmes plus subtils peuvent survenir, en particulier lorsque la manipulation d’échantillons robotisés est impliquée. Ceux-ci emploient une ou plusieurs sondes d’échantillon fixe ou sonde (s) avec des pointes jetables. La plupart sont basées sur le déplacement du liquide et ne fonctionnent pas de manière optimale s’il y a de l’air dans la tubulure ou une soupape qui fuit ou une pointe de seringue.

Le report de l’échantillon peut être un problème particulier avec les instruments à sonde fixe.Souvent, les fabricants citent des chiffres compris entre 0,01 et 0,001% pour le report. Dans les tests de dépistage de drogues, il est courant de trouver des échantillons très élevés qui contaminent les échantillons après une analyse. Par exemple, un échantillon contenant 500 mg / L transfère 50 μg / L à un taux de transfert de 0,01%. Un lavage intensif de la sonde sur ses surfaces externe et interne réduit le transfert à des niveaux acceptables, bien que cela ait l’effet néfaste de ralentir le pipetage de l’échantillon. Les réactifs peuvent également être contaminés ou dilués les uns avec les autres d’une manière similaire, il est donc conseillé de ne pas les ajouter avec un instrument à sonde fixe. Les instruments à pointe jetable sont de loin supérieurs à cet égard, puisqu’ils n’ont aucun report.

Comme pour tout instrument, un entretien régulier et des tests de performance sont essentiels pour obtenir des résultats fiables. Un simple test de colorant ou de pipettage par radioactivité est satisfaisant pour démontrer la précision et la précision du pipetage, à condition qu’il imite le dosage immunologique et l’échantillon aussi fidèlement que possible. Cela semble être une évidence, mais la plupart des dosages immunologiques utilisent des volumes relativement faibles (typiquement <100 μL), alors que de nombreux fabricants d’instruments recommandent de tester à des volumes plus élevés (500 à 1000 μL).

Un problème particulier pour les analyseurs de chimie utilisant des dosages homogènes est la formation de bulles ou de mousse dans la coupelle d’échantillon. Ceci est suffisant pour activer le capteur de niveau de liquide et entraîner l’aspiration de l’air à la place de l’échantillon.L’aspiration des réactifs peut être affectée de la même manière. Les sondes pliées ou endommagées peuvent également provoquer des effets similaires pouvant entraîner une mauvaise réplication, des faux négatifs et des résultats positifs.

Le déplacement progressif des valeurs de contrôle dans une direction au cours d’une analyse peut être décrit comme une dérive du dosage. Cela peut se manifester soit comme une augmentation ou une diminution de la concentration à travers une course. La cause de ce problème est une altération de la cinétique du dosage dans le lot, et résulte de deux facteurs.Premièrement, le temps d’incubation pour de nombreux tests en phase solide est relativement court (pour permettre un débit élevé) et l’ajout d’échantillons et de réactifs en temps opportun est nécessaire. Deuxièmement, étant donné que la vitesse de réaction d’un essai augmente généralement avec la température, il faut veiller à ce que les réactifs atteignent la température de fonctionnement. Les réactifs pipetés directement dans les premiers tubes ou puits de 2 à 8 ° de stockage ont plus de temps de préchauffage que les tubes ou les puits postérieurs et ont donc une cinétique de réaction différente.

Le lavage (étape de séparation) d’un essai enzymatique hétérogène est une étape critique, puisque la plupart des dosages emploient un large excès d’enzyme, dont la plus grande partie est éliminée avant la génération du signal. Les volumes de lavage doivent être réglés pour remplir le puits ou le tube de dosage, et l’aspiration des déchets doit être réglée pour être aussi complète que possible. Le temps de trempage est d’importance égale et doit être réglé entre 30 secondes et 2 minutes. Pour les essais sur microplaque, il est habituel de laver soit par colonne sur la plaque ou par rangée le long de la plaque en utilisant une tête de lavage à huit ou à 12 voies, respectivement. Un blocage partiel d’une sonde peut entraîner un lavage inefficace, ce qui entraînera une imprécision. Dans une plaque d’échantillons répétés utilisant une tête de lavage à huit voies, ceci donne une répétition médiocre sur chaque quatrième paire tout au long de la série. Le colmatage des orifices d’aspiration ou des sondes de distribution peut se produire par l’accumulation de sels tampons de lavage et de matériel d’échantillonnage, de sorte qu’une maintenance régulière est essentielle pour une bonne performance. Le rinçage automatique de l’eau à travers la tête de lavage est une caractéristique utile à cet égard.

Des dispositifs de lecture tels que les compteurs gamma et les lecteurs de microplaques peuvent également provoquer une imprécision intra-essai. Dans le but d’améliorer le débit, de nombreux instruments sont équipés de plusieurs dispositifs de lecture (p. Ex. Compteurs gamma à têtes multiples). Il est essentiel que ces appareils soient adaptés les uns aux autres et vérifiés régulièrement.

Des modifications non validées du protocole d’immunodosage peuvent entraîner une imprécision intra-essai. Les immunodosages commerciaux sont optimisés pour fonctionner avec un volume d’échantillon et une matrice particuliers. Un certain nombre de paramètres peuvent être modifiés pour répondre aux besoins des utilisateurs, mais de tels changements doivent être validés. La validation devrait impliquer des tests approfondis sur un minimum de trois lots de réactifs différents, et pour les trousses commerciales, le fabricant devrait être en mesure d’aider et de conseiller.

Imprécision lot à lot

Toute cause d’imprécision intra-essai a un effet néfaste sur la précision d’un lot à l’autre. À condition que le matériel de contrôle ait été validé pour l’utilisation avec le dosage immunologique en question, il servira de moyen d’évaluer la précision de lot à lot. Comme discuté précédemment, une telle validation implique l’évaluation d’un certain nombre de lots de kit et de matériel de contrôle. Si cette validation n’a pas été complétée, des problèmes peuvent survenir. Quelques exemples de causes de problèmes dérivés du matériel de contrôle lui-même comprennent:

  • Niveau de médicament au-delà de la plage d’étalonnage (supérieure ou inférieure) du test.
  • Effet matriciel par l’utilisation d’un contrôle basé sur l’animal qui se comporte différemment du matériel (humain par exemple) testé.
  • Utilisation d’un témoin dans une matrice dans un immunodosage conçu pour une autre matrice (par exemple, un contrôle d’urine utilisé dans un test de plasma).
  • Reconstitution inadéquate du matériel de contrôle et détérioration du matériel de contrôle par un stockage à long terme ou des cycles répétés de congélation-décongélation.

Lors du choix d’un contrôle de médicament commercial, il est important de considérer la réactivité croisée de l’immunodosage. Les contrôles peuvent contenir plusieurs congénères du même groupe de médicaments qui pourraient être reconnus dans le dosage immunologique et donner des résultats plus élevés que prévu. Inversement, si le contrôle contient un mélange d’isomères, des résultats plus faibles que prévus peuvent se produire si l’immunodosage présente une réactivité croisée plus élevée avec un isomère par rapport à un autre.

Les immunodosages peuvent être utilisés qualitativement pour fournir une réponse positive ou négative, semi-quantitativement pour donner des résultats approximatifs, ou quantitativement pour donner la valeur la plus précise. Pour un criblage simple, la comparaison avec un calibrateur de coupure est suffisante. L’utilisation d’une courbe semi-quantitative permet d’estimer la concentration de médicament utile dans certaines circonstances, par exemple lors de la confirmation du résultat par une autre méthode. Si un résultat plus précis est requis, une courbe d’étalonnage complète peut être nécessaire (voir Fig. 9).

Il existe une pléthore de logiciels et d’options d’ajustement de courbe qui transformeront à la fois les axes et la courbe d’étalonnage pour une réduction quantitative et semi-quantitative des données. Cependant, beaucoup de ces options ne sont pas compatibles avec certains tests et conduisent à des résultats erronés s’ils sont mis en œuvre. En effet, les mêmes données brutes appliquées à la même courbe peuvent donner des résultats significativement différents. Ce test de robustesse devrait idéalement être réalisé à l’étape de validation de l’évaluation de la méthode.

Performance d’évaluation externe de la qualité

Comme indiqué ci-dessus, toute cause d’imprécision à l’intérieur d’un essai ou d’une imprécision d’un lot à l’autre peut se refléter dans la performance de l’assurance qualité externe ( AQ ).Cependant, les échantillons de ces schémas représentent une petite fraction de la charge de travail du laboratoire et ne devraient pas être invoqués pour indiquer des problèmes de CQinterne.

L’ AQ externe profite à la communauté des essais de médicaments en permettant au même échantillon d’être testé par un grand nombre de laboratoires en utilisant une variété de méthodes. Cela permet également de faire circuler des échantillons inhabituels ou difficiles.L’objectif de ce type de système est de parvenir à un consensus entre les différents sites de test et de rechercher des variances spécifiques à une méthode ou à un lieu. Le laboratoire individuel est capable de voir que ses performances correspondent à celles des autres.

Exemple d’adultération

Les donneurs de spécimens (patients, employés, détenus) peuvent ne pas vouloir que l’écran de dosage immunologique fonctionne correctement et peuvent prendre des mesures pour adultérer leur spécimen. C’est en grande partie un problème associé au dépistage de l’urine pour les drogues d’abus; les cheveux, le sang et la salive sont moins susceptibles d’être adultérés. Des mesures pour contrer ce problème comprennent l’observation de la collecte de l’échantillon, ainsi que des tests physiques et chimiques pour confirmer que l’échantillon est fraîchement vidé et de l’individu testé. Les tests comprennent la mesure de la température de l’échantillon au point de collecte, des tests sur place ou en laboratoire du pH, de la densité relative et de la concentration urinaire de la créatinine. Des tests plus spécifiques peuvent être effectués pour des adultérants particuliers.

L’effet de l’adultération des échantillons diffère selon le type d’analyse. Certains tests produisent des résultats faussement négatifs, alors que d’autres produisent des résultats artificiellement élevés.

La clé de l’application réussie du dosage immunologique dans le cadre d’un régime de test est la connaissance des caractéristiques du test utilisé et la connaissance des limites ainsi que les avantages de chacune des nombreuses variantes de la méthode. [1]

Share Button

Comments

So empty here ... leave a comment!

Laisser un commentaire

Sidebar