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Dosage de l’acide mycophénolique (MPA) par HPLC

Lacide mycophénolique (MPA) est un agent immunosuppresseur, indiqué en transplantation d’organes contre le rejet d’organe. Administré sous forme de mycophénolate mofétil, il est rapidement transformé en acide mycophénolique, le métabolite actif, par hydrolyse in vivo.

Mécanisme d’action

L’acide mycophénolique est un puissant inhibiteur sélectif, non compétitif et réversible de l’inosine monophosphate déshydrogénase ; il inhibe donc, sans être incorporé à l’ADN, la synthèse de novo des nucléotides guanine. Étant donné que la prolifération des lymphocytes B et T est essentiellement dépendante de la synthèse de novo des purines, et que d’autres types de cellules peuvent utiliser des voies métaboliques « de suppléance », l’acide mycophénolique a un effet cytostatique plus marqué sur les lymphocytes que sur les autres cellules. [1]VIDAL – Acide Mycophénolique, consulté le 13/10/2017

Figure 1. Structure de l’Acide Mycophénolique

Dosage

Cet article décrit la procédure interne du dosage de l’acide mycophénolique (MPA) par HPLC dans le sang.

Portée

Cette procédure s’applique à tous les prélèvements de sang total dans le cadre du suivi thérapeutique.

APPREILLAGE

1 Chromatographe liquide à haute performance,  équipée de :

– Un dégazeur Spectra System SCM1000.

– Une pompe Spectra System P1000XR.

– Détecteur  Spectra System UV100.

– Une colonne thermo 250*4.6- C18.

– Interface  Spectra System SN4000.

2. micro-seringue à aiguille  scéllée HAMILTON de volume nominal 100 µL.

3. Centrifugeuse THERMO.

4. Vortex WirliMixer.

Les conditions opératoire sont indiquées dans letableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 

Préssion                      Débit                       Longueur d’onde                           Température

240 bars                        1,5ml/min                         215 nm                                      ambiante

Réactifs

1. Acide othophosphorique 84%.

2. Acétonitrile  grade HPLC.

3. Naproxène sodique(NopainR).

4. Acide mycophénolique  98%(SIGMA).

Procédure

Préparation des solutions pour le traitement d’échantillon.

1. Solution Stock de l’MPA 1g/l (S.S) :

*Peser 10 mg qsp 10 ml de méthanol.

2. Solution fille(S.F) à 250mg/l :

*500µl de S.S qsp 2ml eau distillée.

3. Etalon Interne (Naproxène sodique-NopainR) à 10mg/l dans le méthanol :

   * Solution Naproxène à 1g/l : 20mg ( poudre de cp correspond à 10 mgde Naproxène) qsp  10ml de methanol.

   * Etalon interne à 10mg/l : 100µl  de l’EI(1g/l)  qsp 10ml de méthanol.

4. Phase mobile : acetonitrile  – eau acidifiée pH3 (43/57 – V/V).

5. Eau acidifiée : acidifier l’ eau distillée avec l’acide orthophosphorique à pH 3.

6. Solvant d’extraction : acetonitrile – eau acidifiée pH3 (80/20 – V/V).

COURBE D’ÉTALONNAGE : 

Conc. mg/l 6,25 62,5 125 187,5 250
S.F à 400mg/l 50µl 100µl 200µl 300µl
Méthanol(µl) Qsp 2ml 300 200 100

La deuxième série de dilution (dans le serum blanc) :

On fait une dilution au 1/10ième des solutions filles précédantes dans le serum blanc pour avoir des solutions à 1, 10, 20,30 et 40 mg/l, comme indiqué dans le tableau suivant :

  sf1 sf2 sf3 sf4 sf5
Conc. mg/l 1 10 20 30 40
Dilution 1/10 ième des S.F 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl
Serum blanc (qsp) 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl

Traitement des  échantillons : dans des tubes Eppendorf mettre  

Conc.mg/l 0,625 6,25 12,5 18,75 25
Dilution 1/10 ième 200 µl sf1 200 µl sf2 200 µl sf3 200 µl sf4 200 µl sf5
E.I à 10mg/l 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl
Solvant d’extract 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl

– Agiter  au vortex pendant 20s. Centrifuger à 12000g pendant 5mn.

– Injecter 50µl.

On trace la courbe :

    Surface du pic =  b[MPA]+a

Surfacedu pic = fc (conc. en MPA)

Y = b [MPA] + a

-Calcul de la concentration en MPA chez les patients :

[MPA]patient = (Y – a)/b

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Références   [ + ]

1. VIDAL – Acide Mycophénolique, consulté le 13/10/2017

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