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Dosage de l’Isoniazide et de la Pyrazinamide (3 heures) par HPLC

Cet article décrit  la procédure interne du dosage de l’isoniazide et de la pyrazinamide par HPLC dans le sang. Cette procédure s’applique à tous les prélèvements de sang dans le cadre du suivi thérapeutique.

APPAREILLAGE

1. Chromatographe liquide à haute performance,  équipée de :

– Un dégazeur Spectra System SCM1000.

– Une pompe Spectra System P1000XR.

– Détecteur  Spectra System UV100 à barette de diode.

– Une colonne thermo C18 250*4.6,5µm (avec précolonne C19).

– Interface  Spectra System SN4000.

2. micro-seringue à aiguille  scéllée HAMILTON de volume nominal 100 µL.

3. Centrifugeuse THERMO.

4. Vortex WirliMixer.

Les conditions opératoire sont indiquées dans letableau 1 ci-dessous.

Préssion                      Débit                       Longueur d’onde                           Température

 

250 bars                        1,2ml/min                         275 nm                                      ambiante

RÉACTIFS

1. Chloroforme.

2. Acide orthophosphorique  à 84% .

3. Butanol à 99,5%.

4. Chlorure de sodium.

5. Ammiaque à 31%.

6. Acétonitrile HPLC.

7. Acide acétique à 99,7%.

8. produit pure de l’isoniazide.

9. produit pure de nicotinamide.

10. produit pure de pyrazinzmide.

Procédure

Préparation des solutions pour le traitement d’échantillon.

1. Solution Stock de l’INH 1g/l (S.S) : stabilité 6mois à +4°c

*Peser 25 mg qsp 25 ml de méthanol.

2. Solution Fille(S.F. INH) à 20mg/l : extemporanée

*500µl de S.S qsp 25ml eau distillée.

3. Solution Stock de pyrazinamide à 1g/l : stabilité 6mois  à +4°c

* 25mg qsp 25ml de méthanol.

4. Solution fille(S.F. PZN) à 400mg/l : extemporanée

*1000µl de S.S qsp 1,5ml eau distillée.

5. Etalon Interne nicotinamide à 1g/l: stabilité 6mois  à +4°c

   * Peser 25mg  qsp  25ml de methanol.

   * Etalon interne à 12mg/l : 300µl  de la S.S  qsp 25ml d’eau distillée. stabilité 3mois  à +4°c

6. Tampon acétate d’ammonium 0,05M : 1,5ml d’acide acétique qsp 500 ml d’eau distillée. Ajuster le pH à 6 avec l’ammoniaque NH4OH

7. Solvant d’extraction : chloroforme/butanol (70/30 – v/v).

Préparation des solutions filles de la courbe d’étalonnage :

A partir de la solution à 40 mg/l d’INH on prépare des solutions filles.

sf1 sf2 sf3 sf4 sf5
Concentration (mg/l) 1,25 2,5 5 10 20
Volume prélevé de la solution d’INH à 20mg/l (ml) 0,1 0,1 0,2 1  
Eau distillée (ml) 1,5 0,700 0,6 1  

A partir de la solution à 400 mg/l de PZN on prépare des solutions filles.

sf°1 sf°2 sf°3 sf°4 sf°5
Concentration (mg/l) 25 50 100 200 400
Volume prélevé de la solution de  sf. PZN(ml) 0,1 0,1 0,2 0,2  
Eau distillée (ml) 1,5 0,7 0,6 0,2  

On fait des dilutions au 1/5ème à partir des solutions filles  précédentes pour avoir les concentrations suivantes :

  • Pour l’INH :0,5, 1, 2, 4, 8 mg/l
  • Pour la PZN : 5 ; 10; 20; 40 , 80mg/l
Point 1 2 3 4 5
Solution fille d’INH (mg/l) à 1,25 2,5 5 10 20
Solution fille de PZN (mg/l) à 5 10 20 40 80
Volume prélevé de la solution fille d’INH (ml) 0,1sf1 0,1sf2 0,1sf3 0,1sf4 0,1sf5
Volume prélevé de la solution fille de PZN (ml) 0,1sf°1 0,1sf°2 0,1sf°3 0,1sf°4 0,1sf°5
Eau distillée (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Courbe d’étalonnage : Dans des tubes de 10cc.

Standards (mg/l) et échantillons Blanc Point 1 Point 2 Point 3 Point 4 Point 5 Sérum
S° à analysée 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl
NaCl à 200g/l                      200µl                                           200µl

 

Chlorof/butanol (70/30)                                                           5ml
Extraction 1             Mettre au vortex 5“, extracteur rotatif 10’ puis centrifugation à 3000t/mn  pdt 10mn
Eliminer la phase aqueuse supérieure par aspiration. On récupère 4ml de la phase organique dans un autre tube de 5cc.
H3PO4     30mM                     500µl                                           500µl
Extraction 2

     

Mettre au vortex 5“, extracteur rotatif 10’ puis centrifugation à 3000t/mn pdt 10mn
Remplir 400µl de la phase aqueuse supérieure dans un autre tube.
Nicotinamide       

à 12mg/l

                                            100µl
Mettre au vortex 5“,  puis injecter 20µl.

 

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