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Dosage de la Vancomycine par HPLC

Cet article décrit la procédure interne du dosage de la vancomycine par HPLC dans le sang. Cette procédure s’applique à tous les prélèvements de sang dans le cadre du suivi thérapeutique.

APPAREILLAGE

1. Chromatographe liquide à haute performance,  équipée de :

– Un dégazeur Spectra System SCM1000.

– Une pompe Spectra System P1000XR.

– Détecteur  Spectra System UV1000 à barette de diode.

– Une colonne thermo C8.

– Interface  Spectra System SN4000.

2. Micro-seringue à aiguille  scéllée HAMILTON de volume nominal 50 µL.

3. Centrifugeuse THERMO.

4. Vortex WirliMixer.

Les conditions opératoire sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous .

Pression                      Débit                       Longueur d’onde                           Température

 

….   bars                        1,50ml/min                         210 nm                                      25°C

RÉACTIFS

1. Acide perchlorique 60% .

2. Tampon phosphate pH=2,8.

3. Acétonitrile pour analyse.

4. Solution injectable de la vancomycine

5. Ceftazidim

Procédure

Préparation des solutions :

1. Solution Stock de la vancomycine 5g/l (S.S) :

*500  mg qsp 100 ml d’eau distillée.

2. Solution intermédiaire à 200mg/l  (SI):

*2ml de S.S qsp 50ml eau distillée.

3. Préparation d’une solution d’étalon interne : 

    *Ceftazidim  à 300 mg/l

Tenir à l’abri de la lumière et conserver à basse température.

4.Solution tampon :

*KH2PO4 ( 0,005M) : peser 0,6804 g qsp 1000 ml

* H3PO: pH=2 ,8

5. Acide perchlorique 6% : dilution 1/10 eme d’acide perchlorique 60%

6. Phase mobile : acétonitrile , tampon phosphate (gradient)

Préparation des points de calibration ( dans le serum) :

Les concentrations : 5, 50, 100 mg /l

  • SF3 (100 mg/l) : 1ml SI ……..qsp 2ml
  • SF2 ( 50 mg /l) : 1ml SF3 ……qsp 2ml
  • SF1 (5 mg /l) : 100 µl SF2 …..qsp 1ml

Traitement des calibrateurs ou de l’echantion :

Concentration (mg/l) 5 50 100 Echantillon
Volume prélevé des (sf1,2,3, Ech) 100µl 100 µl 100 µl 100µl
Serum (ml) 100µl 100 µl 100 µl 100 µl
Ceftazidim 300mg/l 20µl 20µl 20µl 20µl
Acide perchlorique  6% 100µl 100µl 100µl 100µl

Préparer un blanc comme suite :

– 100µl H2O distillée.

– 100 µl serum

– 100 µl acide perchlorique  6%

– 20 µl ceftazidim

Vortexer , centrifuger  10minutes,  injecter 50 µl.

On trace la courbe :

Rapport de surface VANCO/EI = fc (conc. en Vanco.)

Y= b [VANCO] + a

Calcule de la concentration en Vanco. Chez les patients :

[VANCO]= (y-a)/b

Figure 1. courbe d’étalonnage de la Vancomycine

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