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Dosage du Méthotrexate par HPLC-DAD

Le présent article décrit la procédure interne du dosage du méthotrexate par HPLC-DAD dans le sang.

Le méthotrexate (abréviation : MTX ; anciennement : améthoptérine) est un antimétabolite utilisé dans le traitement de certains cancers et maladies autoimmunes. Le méthotrexate inhibe la dihydrofolate réductase, une enzyme capitale dans le métabolisme de l’acide folique.

Figure 1. Analogie structurale entre le Méthotrexate et l’Acide folique

Figure 2. Mécanisme d’action du Méthotrexate

Cette procédure s’applique à tous les prélèvements de sang dans le cadre d’un suivi thérapeutique.

Appareillage

1. Chromatographe liquide à haute performance,  équipée de :

– Un dégazeur Spectra System SCM1000..

– Une pompe Spectra System P1000XR.

– Détecteur Finnigan Spectra System UV6000LP à barrette de diode.

– Une colonne thermo 250*4.6- C18.

– Interface  Spectra System SN4000.

– Four à colonneEppendorf CH-500.

Les conditions opératoire sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.

 

                                                                          Tableau 1 

 

Préssion                      Débit                       Longueur d’onde                           Température

 

240 bars                   1,6ml/min                         313 nm                                             40°

 

2. micro-seringue à aiguille  scéllée HAMILTON de volume nominal 100 µL.

3. Centrifugeuse THERMO.

4. Vortex WirliMixer.

Réactifs

1. HCl à 37%.

2. Acétate d’ammonium 98%.

3. Acétonitrile grade HPLC.

4. Acide trichloracétique 99,5%.

5. Méthotrexate produit pur 99% (SIGMA).

Procédure

– Préparation des solutions pour le traitement d’échantillon.

1. Préparation de la solution mère de méthotréxate à 100.000ng/ml(S.S):

Peser 0,00112g qsp 10ml à 10mM. Solution stable pendant 01 mois à +4°C.

2. Solution HCL 10mM : 420µL HCL à 37% qsp 500ml eau distillée.

3. Solutiond’Acétate d’ammonium à 50 mM : peser 1,927g qsp 500ml eau distillée.

4. Acide trichloracétique (TCA) à 20% dans l’ACN :

* Peser 2g TCA qsp 10ml acétonitrile à 20% (2ml ACN qsp 10ml H2O).

5. Phase mobile : acétonitrile (HPLC)-acétate d’ammonium 50Mm ( 7/93-V/V).

-Première série de dilution(dans l’Hcl 10mM)

On prépare des solutions filles dans l’Hcl 10mM à des concentrations à :

500, 2500, 5000, 12500, 25000, 50000.

                                                                     Tableau 2 :

  sf1 sf2 sf3 sf4 sf5 sf6
Conc. (ng/ml) 500 2500 5000 12500 25000 50000
Solution MTX 50µl S.F 100µl S.F 50µl S.S 50µl S.S 50µl S.S 100µl S.S
HCl 10mM 450µl 100µl  950µl 350µl 150µl 100µl

Agiter au vortex pendant 10 sec.

– Deuxième série de dilution (dans le serum blanc) :

On fait une dilution au 1/5ème des solutions filles précédantes dans le serum blanc pour avoir des solutions à 100, 500, 1000, 2500, 5000 et 10000 ng/ml, comme indiqué dans le tableau 3.

                                                                    Tableau 3 :

sf1° sf2° sf3° sf4° sf5° sf6°
Conc. (ng/ml) 100 500 1000 2500 5000 10000
Solution MTX  100µl sf1 100µl sf2 100µl sf3 100µl sf4 100µl sf5 100µl sf6
Serum blanc 400µl 400µl 400µl 400µl 400µl 400µl

Agiter au vortex pendant 60 sec.

-Traitement des calibrateurs ou de l’échantillon :

On fait une précipitation avec du TCA à 20% :

  • 400µl (calibrateurs de serum/ patient/ contrôle qualité).
  • 100µl TCA à 20%.

-Agiter au vortex pendant 60 sec, et centrifuger à 12000 g pendant 5 mn.

-Injecter 50 µl du surnageant dans le système HPLC.

On trace la courbe :

    Surface du pic =  b[MTX]+a

Surface du pic = fc (conc. en MTX)

Y = b [MTX] + a

Calcul de la concentration en MTX chez les patients :

[MTX]patient = (Y – a)/b

 

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