Abonnez-vous par e-mail.

    Saisissez votre adresse e-mail pour vous abonner et recevoir une notification de chaque nouvel article par email.

    Rejoignez 36 autres abonnés

Extraction liquide-liquide (Marcoux) pour l’Analyse par HPLC

Le présent article décrit  la procédure  d’extraction liquide-liquide établie par Marcoux en 2002 par  HPLC dans les liquides biologiques.

Portée

Cette procédure s’applique à tous les milieux biologiques  dans le cadre d’une recherche de toxiques.

Appareillage

Chromatographe liquide à haute performance,  équipée de :

– Un dégazeur Spectra System SCM1000.

– Une pompe Spectra System P1000XR.

– Détecteur  Spectra System UV100 à barette de diode.

– Une colonne thermo 250*4.6- C18.

– Interface  Spectra System SN4000.

– Four à colonne Eppendorf CH-500.

Micro-seringue à aiguille  scellée HAMILTON de volume nominal 100 µL.

Centrifugeuse THERMO.

Vortex WirliMixer.

Les conditions opératoire sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.

 

                                                               Tableau 1

Préssion                      Débit                       Longueur d’onde                           Température

 

160 bars                      1,3ml/min                         210 nm                                         30°

 

 

Réactifs

1. Dichlorométhane 99,8%.

2. Heptane pur.

3. Isopropanol 99,8%.

4. Chlorure d’ammonium.

5. Acide phosphorique  à 84%.

6. Acétonitrile HPLC.

7. Dihydrogenophsphate de potassium  99%.

8. Ammoniaque.

9. Pyridine.

10. Anhydride acétique.

11. Produit pure de paroxétine.

Procédure

Préparation des solutions pour le traitement d’échantillon.

1. Phase organique d’extraction :

*60 ml Dichloromethane.

*26 ml Heptane.

*14 ml Isopropanol.

2. Le tampon Chlorure d’ammonium à pH 9,5 :

(33.5 g de chlorure d’ammonium  +  42 ml d’ammoniaque) ………………….qsp 250 ml d’eau distillée.

Ajuster  avec l’acide chlorhydrique.

3. La phase mobile :

* 1,701 g …………………………………………………..qsp 500 eau distillée.

5. Acétylation de la paroxétine :

   * Peser 10 mg  qsp  1 ml du mélange (1 volume pyridine + 1 volume  anhydride acétique).

   * Mettre le tube dans l’étuve à 70°C pendant 30 minutes.

* Ensuite évaporer sous flux d’azote au bain-marie à 70°.

Traitement d’échantillon /contrôle/standard:

Dans un tube de 10 cc mettre :

  • 1000 µl serum
  • 1000 µl
  • 20 µl étalon interne  à 200 µg/l
  • Vortexer
  • Ajouter 8 ml de la phase organique d’extraction
  • Agiter par retournement 2 à 3 fois
  • Extraction par rotateur en position verticale pendant 10 min
  • Centrifuger à 3000tr /mn pendant 5 mn
  • Aspirer la phase aqueuse supérieure
  • Transvaser dans un autre tube de 10 cc et secher sous azote à 40°C
  • Récuperer le résidu d’évaporation par 200 µl Eau-Méthanol (50 :50) et bien vortexer
  • Transvaser dans un ependorff et centrifuger à 13000 tours/min pdt 15 min
  • Récupérer le surnagent dans un autre Ependorff et injecter 50 µl.
Share Button

Comments

So empty here ... leave a comment!

Laisser un commentaire

Sidebar