Extraction des toxiques organiques fixes

L'extraction est un procédé de séparation très utilisé en analyse immédiate, ce procédé consiste à séparer une ou plusieurs substances d'une matrice biologique (sang, urines, bile, liquide de lavage gastriques etc). Elle comprend l'extraction liquide-liquide et l'extraction en phase solide. La distribution d'un soluté entre deux phases non miscibles suit un équilibre régi par le coefficient de partage (généralement noté K ou P, qui est le rapport des activités chimiques d’un soluté entre deux phases). L’isolement des toxiques organiques fixes est difficile car il faut :

• Une extraction de toxiques retrouvés au sein de la matière organique complexe (les viscères).
• Unes extraction d'une infime quantité qui est diluée dans une masse considérable d'organes.
• Extraire sans altérer les toxiques, qui doit être à l’état pur et exempt de toute impureté qui pourrait perturber les réactions de détection.

Principe

Le principe est fondé sur la distribution du soluté entre deux phases, en fonction des trois propriétés suivantes :

• Différence de solubilité selon le pH du solvant
• Différences de solubilité en fonction du PM de soluté
• Valeurs de leurs coefficients de partage entre deux liquides non miscibles.

La technique d’extraction permet d’effectuer aussi une pré-concentration (ou enrichissement) étape indispensable lorsque la méthode de détection n’est pas suffisamment sensible. Les techniques d’extraction ou d’enrichissement peuvent être classées en deux catégories :

• Réduction du volume du solvant après extraction liquide d’un échantillon solide ou liquide.
• Extraction , sur support solide, des composés dissous dans un échantillon liquide suivi d’une élution dans un faible volume de solvant approprié.

Extraction liquide-liquide (LLE)

Le soluté se partage entre 2 liquides, non miscibles un équilibre s’établit: Un solvant dissout bien un composé qui lui ressemble  «qui se ressemble s’assemble » :

• Les solvants polaires et dissociants tels que l’eau dissolvent les composés ioniques et/ou polaires hydrophiles;
• Les solvants apolaires et peu dissociants dissolvent les molécules et les composés hydrophobes (solvants chlorés ou des hydrocarbures).

Le choix du solvant d’extraction

Le solvant idéal pour une LLE doit être :

• Non miscible à l’eau et de préférence moins dense que l’eau
• Stable et inerte chimiquement
• De faible toxicité (par inhalation et/ou par contact)
• Pas très couteux et disponible à une pureté élevée
• Doté d’un bon pouvoir extractif
• De volatilité suffisante pour être évaporer après extraction, mais pas trop importante pour éviter les pertes durant l’extraction.
• N’absorbe pas dans l’UV et ne présente pas d’activité électrochimique.
• Sans réponse ou effet délétère sur les détecteurs à capture d’électron ou de masse.

Les solvants les plus utilisés dans les laboratoires de toxicologie sont l’éthyle acétate, acétone, chloroforme, toluène, dichlorométhane, butyl acétate et diéthyle éther. Ces solvants ont des pouvoirs extractifs proches (Flanagan,2007). On peut augmenter le nombre de molécules extractibles en utilisant des mélanges de solvants. Les plus fréquemment utilisés sont chloroforme/ heptane/ 2-propanol, toluène/ acétate d’éthyle ou hexane/ diéthyléther  (Kintz ,2012). Les alcools tels que le 2-propanol or 3-methylbutanol favorisent la formation de ponts hydrogène, ils peuvent être ajoutés aux solvants aprotiques afin d’augmente l’extraction des substances relativement hydrosolubles et de diminuer l’adsorption des composés basiques aux supports en verre (Flanagan,2007).

Choix du pH 

L’extraction doit être réalisée à un pH pour lequel les analytes se trouvent à l’état moléculaire non ionisé. Cela suppose que les molécules acides sont extraites à un pH acide, et les molécules basiques à un pH alcalin, aboutissant ainsi pour chaque milieu biologique à deux extraits qui devront être séparément analysés. Ceci peut constituer un inconvénient en toxicologie d’urgence car double le temps d’analyse. Les médicaments impliqués dans les intoxications aigues étant majoritairement des molécules bases faible, le pH idéal d’extraction est basique. L’utilisation du tampon chlorure d’ammonium saturé pH 9,5 avec un bon solvant d’extraction permet l’extraction des molécules basique avec un bon rendement mais aussi la détection des médicaments  acides (Maurer,1999).

Techniques d'extraction Liquide-Liquide

Méthode de Stas Otto Ogier

L’extraction générale Elle est réalisée à l’aide d’un solvant :

• Simple;
• Ayant un pouvoir dissolvant aussi étendu que possible;
• Inerte au point de vu chimique;
• Floculant les protides au maximum;

Note: le solvant d'extraction nécessite l’ajout d’un adjuvant pour augmenter la dissolution des toxiques;

Stas

Stas Avait choisi l’éthanol et il a accru son action dissolvante par l’addition d’acide tartrique Ce traitement alcoolique de la pulpe de viscères conduit d’une part à l’obtention d’un précipité protidique qui est éliminé par filtration et d’autre part à un filtrat hydro alcoolique contenant l’alcaloïde sous forme de tartrate. Mais à lui seul ce traitement est incapable d’entraîner une floculation quantitative des protéines.

Ogier :

Pour remédier a cet inconvénient, Ogier introduisit une série de floculations successives réalisées de telle sorte que le substrat biologique se trouve progressivement amené à un titre alcoolique de plus en plus important.

Extraction sélective: Elle est basée sur le principe de partage entre deux solvants: Le filtrat aqueux d’extraction générale contient des toxiques organiques :

• De poids moléculaires différents;
• De formules différentes;
• De polarités différentes;
• De pKa différents.

Le filtrat définitif précèdent tamponné a des pH variables soumis a une extraction massive et successive au moyen de solvants organiques non miscible a l’eau.

Méthode de florence

Principe Cette méthode est basée:

• sur la solubilisation des toxiques dans l’eau;
• sur l’action floculante protéinique de l’acide trichloracétique.

A la fin, traiter la phase aqueuse par épuisements successifs par les solvants (méthode de Stas). Avantages: Rapide et facile; Efficace pour strychnine, morphine, sulfamides et les barbituriques. Inconvénients : La défécation est brutale→ risque de rétention du toxique à l’intérieur du coagulum; La forte acidité hydrolyse les hétérosides et certains alcaloïdes.

Méthode de Fabre

Principe Dans cette méthode les protéines ne sont pas floculées, mais elles sont solubilisées au moyen de la trypsine. Le liquide aqueux est soumis aux extractions classiques. Avantages Elle donne  des résidus très purs; Rapide et facile; Elle est efficace même pour les toxiques fragiles (atropine, cocaïne).

Méthode a l’électrodialyse

Principe On place une bouillie aqueuse de l’organe entre deux membranes hémiperméables en contact avec l’eau distillée. L’anode et la cathode sont plongées dans l’eau distillée. Le toxique franchit sélectivement les membranes; et sera orienté selon sa polarité et se concentre dans l’un des deux bacs. Avantages Obtention des résidus a l’état pur; Elle est quantitative et bonne pour les alcaloïdes. inconvénients Les ions minéraux, au contact des électrodes, donne des réactions secondaires (oxydation, réduction) qui peuvent altérer les toxiques.

Extraction automatique par solvant (ASE) sous pression à chaud

La technique d’extraction sous pression à chaud par solvant est une méthode d’extraction pour échantillons solides ou semi-solides. Le rôle de la température est d’augmenter la cinétique de l’extraction, diminue la viscosité du solvant permettant une meilleure pénétration du solvant à travers la matrice et un accroissement de la solubilité des analytes. L’effet de la température a également pour conséquences de réduire le temps d’extraction et de diminuer la quantité de solvant utilisée. Le matériel utilisé est un extracteur automatique ASE 200 ( Accelerated Solvent Extraction). Application hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)

Méthodes générales de purification des extraits

Quelles que soient les méthodes d’extraction utilisées on obtient finalement deux solutions : éther acide et éther alcaline qui contient les substances toxiques, c’est pour cela, on procède à la purification qui a pour but d’éliminer les impuretés qui gênent les réactions d’identification. Déshydratation Dessécher l’éther ou le chloroforme avec du sulfate de sodium anhydre. Cette opération est aisément réalisée par agitation. On élimine ensuite le sulfate de sodium par simple filtration quantitative. Purification de l’éther acide Diverses méthodes ont été proposées

• La réextraction;
• Purification au sous acétate de plomb : cas des hétérosides cardiotoniques;
• Purification au noir animal: purification des barbituriques;
• Purification par micro sublimation: C’est une technique qui convient pratiquement à toutes les substances;

Purifications de l’éther alcalin L’éther alcalin est beaucoup plus pur; on procède à une déshydratation et  une réextraction.

Extraction liquide- solide

Principe : Même principe que l'extraction liquide-liquide sauf que les molécules qui retiennent les solutés sont greffés ou adsorbés sur une phase stationnaire. Le choix de la phase stationnaire est fait selon les groupements fonctionnels des solutés à extraire. Les interactions peuvent suivre des mécanismes d'adsorption, d'échange ou de partage.

Séparation par adsorption

Les phases dites adsorbantes sont des supports dont la surface est active par nature (silice, alumine, florisil, carbone, polymères poreux). Les solutés y sont retenus essentiellement par adsorption. Actuellement, la silice est encore la phase (polaire) non greffée la plus utilisée.

• Gels de silice : pour composés basiques :

- pH : 2-8; - particules d'environ 40 μm; - pas soluble dans l'eau ou solvants organiques; - pas cher.

• Alumine : pour les composés acides.
• Polymères organiques : pour les composés aromatiques.
• Fluorisil (Mg₂SiO₃) pour les composés polaires.
• Charbon actif :pour les composés organiques.

Séparation par partage

On utilise des Silices greffées (silanisation du Silanol SiOH). Le mécanisme de partage est réversible. Le mécanisme principal de rétention des analytes organiques est dû à l'interaction de Van der Waals. On essaie d'utiliser un petit volume d'éluant par rapport au volume original de l'échantillon par la suite.

Séparation par échangeurs d’ions

On utilise des polymères organiques tels que : cellulose, polyméthane. Les interactions ioniques ou électrostatiques ont lieu entre un soluté chargé (ionique) et une phase solide portant des charges opposées à celle du soluté. Deux cas d’échanges: cationique (entre charges positives) et anionique (entre charges négatives). Ces interactions sont fortement dépendantes du pH.

Séparation par complexation

Les interactions complexantes ou métal-ligand sont dues à la formation de liaisons datives (covalence de coordination). Elles sont fondées sur les réactions de formation de complexes entre un soluté à séparer et un cation métallique fixé dans la phase stationnaire par liaisons ioniques et (ou) covalentes.

Étapes principales de l'extraction liquide- solide:

 

Figure. Étapes de l'extraction liquide-solide

• Conditionnement : préparation de la colonne pour recevoir l’échantillon liquide à analyser;
• Introduction de l’échantillon et extraction : du soluté sur un support solide approprié(phase stationnaire);
• Lavage : élimination sélective de composés susceptibles d’interférer avec le dosage du soluté considéré par passage d’un solvant approprié;
• Elution : désorption sélective (ou spécifique) du soluté, au moyen d’un faible volume d’un solvant approprié ( enrichissement);
• régénération de la colonne si possible et si nécessaire;

Avantages

Par rapport à l’extraction liquide-liquide, l’extraction liquide-solide présente des avantages notables:

• Rapidité (pas de longues agitations et séparation des phases)
• Sélectivité (un choix large des phases stationnaires et des solvants)
• Économie (faible consommation de solvants)
• Reproductibilité (aucune émulsion à éliminer)
• Enrichissement de traces (même en présence de grands volumes d’échantillons)
• Couplage en ligne avec une séparation chromatographique

Son couplage en ligne apporte, outre son rôle d’extraction et de préconcentration, les avantages suivants :

• Lavage qui permet d’obtenir des chromatogrammes moins chargés et d’améliorer la résolution et  la sensibilité de l’analyse chromatographique.
• Protection de la colonne analytique : par élimination des composés indésirables durant l’extraction des solutés
• Stockage des échantillons : l’utilisation de précolonnes d’extraction permet de realiser l’extraction sur le site même des prélèvements, de stocker les extraits et d’effectuer les analyses en laboratoire.