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Identification de Toxiques par HPLC-DAD

Lidentification de toxiques par HPLC-DAD dans le cadre du Screening Toxicologique au sein du laboratoire de toxicologie repose sur des systèmes modulaires, dont les conditions analytiques préalablement définies par chaque utilisateur pour le screening toxicologique, sont spécifiques à chaque site et nécessitent la réalisation d’une bibliothèque personnelle à partir d’un algorithme d’identification non standardisé.

Matériel

Appareillage

Système de chromatographie liquide haute performance (24)  équipé de :

  • Réservoir de phase mobile (Spectra System SCM1000)
  • Dégazeur en continu (Spectra System SCM1000).
  • Pompe (Spectra System P1000XR) munie d’une valve d’injection avec une boucle de 50µl.
  • Interface  (Spectra System SN4000).
  • Pré-colonne 10×4 mm I.D HYPERSIL GOLD C 18 (taille de particules 5 µm)
  • Colonne THERMO C18 (150×4.6mm).
  • Four à colonne (EPPENDORF CH-500).
  • Détecteur à barrette de diode (Spectra System UV6000LP)
  • Logiciel d’acquisition et d’exploitation des données (CHROMQUEST 4.2.34)
  • Micro-seringue à aiguille scellée HAMILTON de volume nominal de 100 µL.
  • Centrifugeuse (THERMO).
  • Vortex (WIRLI MIXER).
  • Balance de précision (SARTORIUS).
  • Rotateur pour extraction sur tubes.
  • pH mètre (JENWAY).
  • Agitateur magnétique.
  • Fioles jaugées de 10 ml.
  • Matériel habituel pour analyse : micropipettes de différents volumes, fioles jaugées, éprouvettes graduées, tubes en verre de 5 et 10ml.

Figure 1. Système de  chromatographie liquide haute performance utilisé au sein du laboratoire de toxicologie

Réactifs

  • Méthanol 99,9% (Sigma Aldrich)
  • Dichlorométhane 99,8% (Panreac)
  • Heptane pur (Cheminova)
  • Isopropanol 99,8% (Panreac)
  • Chlorure d’ammonium pur (Buchmann)
  • Acide phosphorique 84% (Prolabo)
  • Acétonitril pur qualité HPLC gradient (Sigma Aldrich)
  • Dihydrogénophsphate de potassium 99% (Panreac)
  • Ammoniaque 34% (Cheminova)
  • Pyridine > 99% (Merck)
  • Anhydride acétique 98% (Prolabo)

Etalons

  • Poudres de principes actifs (pureté min 98%) offertes par des laboratoires d’industrie pharmaceutique (80% SAIDAL®) (voir tableau.7)
  • Comprimés et gélules de médicaments obtenus par la pharmacie centrale de l’Hôpital Central de l’Armée (voir tableau.7).
  • Standards purs CHROMSYSTEMS® de différents antidépresseurs tricycliques, benzodiazépines, antiépileptiques et certains de leurs métabolites. Ces standards sont très intéressants car renferment des métabolites non disponibles sous forme pure.

 

Antiépileptiques :

–       Ethosuximide

–       Primidone

–       Lamotrigine

–       Phénobarbital

–       Epoxyde de Carbamazépine

–       Carbamazépine

–       Phenytoine

Benzodiazépines :

–       Chlordiazépoxide

–       Bromazépam

–       Nitrazépam

–       Oxazépam

–       Nordiazépam

–       Clonazépam

–       Clobazam

–       Diazépam

Antidépresseurs :

–        Norclozapine

–        Clozapine

–        Nordoxépine

–        Doxépine

–        Désipramine

–        Imipramine

–        Nortriptyline

–        Amitriptyline

–        Trimipramine

–        Norclomipramine

–        Clomipramine

Matériel biologique : Pool de sérum frais blanc.

Méthode 

La méthode utilisée pour notre travail  est basée sur la procédure analytique adoptée  par  Saint-Marcoux et al. dans le cadre du screening toxicologique large par HPLC-DAD (Saint-Marcoux,2003).

Extraction : consulter l’article: Extraction liquide-liquide (Marcoux) pour l’Analyse par HPLC.

Nous avons choisi cette méthode car elle permet la détection et l’identification rapide et simultanée d’un très grand nombre de molécules en utilisant la même colonne dont nous disposons et une procédure d’extraction liquide-liquide très simple à réaliser et qui nécessite un matériel et des réactifs disponibles et de coût raisonnable.

Conditions chromatographique 

Les conditions chromatographiques sont :

  • Longueur d’onde de lecture du chromatogramme : 210nm
  • Balayage spectral entre 200-400 nm avec une résolution de 1 nm
  • Température : 28°C
  • Phase mobile : mélange d’acétonitril et de tampon phosphate 25mM dont le pH est ajusté à 2,6 par de l’acide ortho-phosphorique.
  • Débit constant de 1,3ml/min
  • Mode d’élution : gradient selon le programme suivant :
Temps (min) Acétonitril (%) Tampon phosphate (%)
0 15 85
2 15 85
36 75 25
39 15 85
43 15 85

La dernière molécule de notre librairie étant éluée à 35 minutes, nous avons adapté notre programme d’élution final de sorte à réduire la durée d’analyse et la consommation de phase mobile en incluant un temps suffisant de rééquilibration pour permettre une injection directe de l’échantillon suivant.

Nous avons aussi fixé la température de la colonne à 28°C afin d’améliorer l’efficacité de celle-ci et surtout pour éviter les modifications des paramètres de rétentions suite aux variations de la température ambiante au cours de la journée et au fil des saisons.

Choix de l’étalon interne

En général, dans toute analyse chromatographique,  un ou plusieurs étalons internes sont utilisés pour permettre une évaluation continuelle de la stabilité du système et ainsi, de s’assurer de la reproductibilité des résultats.

Dans le cadre du STA, la grande majorité des substances recherchées sont des médicaments et pour éviter toute confusion avec les résultats du patient, il est préférable que l’étalon interne ne soit ni une molécule thérapeutique ni un de ses métabolites. Par conséquent, certains auteurs utilisent les dérivés nitro-alcanes (Bogusz,1988 ; Zhang,2011) ou des molécules thérapeutiques dérivatisées lorsque le produit final n’est pas un métabolite probable de la molécule (Saint-Marcoux,2003).

Dans notre travail, nous avons orienté nos essais vers la seconde approche. Ainsi, pour le choix de notre étalon interne, nous nous sommes basés sur notre expérience en analyse par GCMS. En effet, dans le cadre de travaux réalisés sur les antidépresseurs, on constate que l’acétylation de ces derniers est à la fois simple à réaliser, totale et donne des dérivés stables dans le temps. Ainsi, pour notre méthode de screening par HPLC-DAD, le N-Acétyl-paroxétine fut choisi car l’acétylation n’est pas une voie de métabolisation de la paroxétine et synthétisé au sein de notre laboratoire du fait de la disponibilité de la paroxétine pure et notre maitrise du procédé d’acétylation des antidépresseur.

  • Préparation du N-Acétyl-paroxétine

Le N-Acétyle-paroxétine est obtenu par acétylation complète de la paroxétine selon les étapes suivantes (Polettini,1999) :

  • Dissoudre 10mg de paroxétine dans 1 ml de mélange pyridine/anhydride acétique (1:1 v/v)
  • Mettre le tube dans l’étuve à 70°C et laisser en contact pendant 30 minutes
  • Evaporer sous flux d’azote au bain-marie à 70°C
  • Reprendre le résidu sec par 10 ml de méthanol

On obtient ainsi une solution stock  à 1,13 g/l de N-Acétyl-paroxétine à partir de laquelle on prépare une solution de travail à 226 mg/l par dilution au 1/5éme dans un mélange  eau/méthanol (50:50 v/v) et qui sera utilisée en routine. 

  • Conservation de l’étalon interne

La conservation de la solution stock à -20°C conduit à une perte importante par dégradation alors que la solution de travail  conservée à +4°C présente une meilleure stabilité. On opte donc pour une conservation à +4°C des deux solutions.

Figure 2: Chromatogramme et spectre UV obtenu pour la paroxétine pure.

Figure 3: Chromatogramme et spectre UV obtenu pour le N-acétyl-paroxétine.

Etablissement de la librairie locale

L’identification des molécules par HPLC-DAD repose sur la comparaison du spectre UV et du temps de rétention des composés séparés, à ceux des molécules de références comprises dans la librairie intégrée dans le logiciel. La comparaison des spectres est effectuée en utilisant la théorie du contraste spectral où un spectre, transformé en un vecteur, est comparé aux vecteurs (i.e. spectres) de la librairie définissant un angle de reconnaissance dont le cosinus permet de calculer l’indice de similitude (Dehan,2001;Pragst,2004).

Bien que des librairies très larges sont parfois incluses dans les logiciels spécifiques à chaque fabricants ou disponibles sur internet,  la majorité des auteurs préconisent l’utilisation de librairies locales connaissant l’impact des conditions environnementales et expérimentales autant sur la rétention que sur la forme des spectres (Polettini,1999 ; Pragst,2004).

Ainsi, dans le but d’établir une librairie locale, chaque étalon doit être analysé pour obtenir à la fois son temps de rétention et son spectre UV selon la méthode chromatographique choisie et dans les mêmes conditions d’analyse des échantillons biologiques.

Dans notre travail, pour la réalisation d’une librairie locale nous avons procédé selon les étapes suivantes :

Préparation des solutions stock des différents étalons 

Pour chaque molécule, une solution stock à 1 g/l est préparée dans du méthanol pur comme suit :

  • Poudres de principes actifs

Dans une fiole jaugée à 10 ml, dissoudre dans du méthanol pur 10mg de poudre pesés grâce à une balance de précision.

  • Formes pharmaceutiques

Afin d’élargir la librairie à plus de molécules, nous avons préparé des étalons à partir  de comprimés et de gélules en se basant sur les travaux de Hon Kit Lee et al. qui ont  utilisé diverses formes pharmaceutiques pour l’établissement d’une librairie dans le cadre d’un screening large par UPLC et LCMS-TOF (Lee,2009).

Les étalons sont préparés comme suit :

  • Cas des comprimés 

Le comprimé est pesé directement puis broyé en poudre fine. Connaissant le dosage en principe actif, par règle de trois on détermine le poids de la poudre qui renferme 10 mg du principe actif et qui sera dissoute par la suite dans 10 ml de méthanol.

NB : En cas de comprimés pelliculé, après la pesée, la pellicule est soigneusement retirée de sorte à réduire au maximum les pertes, puis le comprimé est broyé.

  • Cas des gélules 

Les gélules sont ouvertes et le contenu pesé. Le poids à dissoudre dans du méthanol est déterminé comme pour la poudre de comprimé.

Toutes les solutions ainsi obtenues sont conservées à – 20°C jusqu’à analyse.

Préparation des mixtures d’étalons

  • Etalons de principes actifs purs et des formes pharmaceutiques 

Vu le nombre important  de molécules à analyser, il est impossible de traiter chaque molécule à part. C’est pourquoi des mixtures contenant un nombre réduit d’étalons (3 à 5) ont été préparées à partir des solutions stocks précédentes dans un mélange eau/méthanol (50:50 v/v) et de sorte à obtenir une concentration de 10 mg/l pour chaque molécule.

Les temps de rétentions de la technique d’origine n’étant pas disponibles, on a établi la composition des mixtures en se basant sur les monographies décrites dans le Clark,2011 et qui donnent pour chaque molécule les temps de rétention obtenus par différents systèmes chromatographiques. Les systèmes HZ et HAA ayant des conditions proches de notre méthode nous orientons notre sélection selon les données de rétention dans ces systèmes de sorte que les molécules d’une même mixture aient des temps de rétentions éloignés pour éviter les coélutions.

Au total 15 mixtures (mixture 1 à 15) ont été préparées à partir des poudres de principes actifs purs et 4 (mixture 16 à 19) à partir de formes pharmaceutiques (Tableau.7).

Tableau 7  Composition des mixtures préparées à partir de poudres de principes actifs et de formes pharmaceutiques

Mixture Molécules
1 INH , Trimipramine, Levomepromazine
2 Olanzapine , Haloperidol , Chlorpromazine
3 Acebutolol, Gliclazide, Indométacine ,Ramipril ,Ropinirol
4 Metformine, Carvedilol, Valsartan, Ibuproféne, Dextropropoxyphéne
5 Oméprazole, Kétoconazole, Loratadine, Piroxicam ,Glimépéride
6 Captopril, Résperidone,Diclofénac, Griséofulvine,Métronidazole
7 Sulpirirde, Paroxétine, Amitriptyline, Betaméthasone,Clopidogrel
8 Prédnisone, Kétoproféne, Lansoprazole, Econazole, Acétyl Salicylique
9 Ranitidine, Aciclovir, Miconazole, Doxilamine,Furosémide
10 Amlodipine, Salbutamol, Doxycycline, Simvastatine, Hydrochlorothiazide
11 Paracétamol, Lamotrigine, Pseudoéphedrine, Fluconazole, Dihydroergotamine
12 Alfuzocine, Fexofénadine, Pyrazinamide, Rifampicine, Acide fucidique
13 Ampicilline, Kétotiféne, Nystatine, Atenolol, Cyanocobalamine
14 Terbutaline, Oxytetracycline, Amiodarone, Atropine
15 Dapsone, Codéine, Cocaine, MPA, Methotrexate
16 Triméthoprime, Sulfaméthoxazole, Hydroxyzine, Spironolactone
17 Codéine, Pentoxifyline, Propranolol, Flécainide, Naproxène
18 Métoprolol, Trimétazidine, Atrovastatine, Fluvastatine
19 Acetazolamide, Betahistine, Doxazosine, Cetirizine, Losartan
  • Les standards CHROMSYSTEMS®

Ces standards sont sous forme de sérums lyophilisés contenant différentes molécules, ils sont reconstitués dans de l’eau distillée selon les consignes du fabricant et subissent avant leur analyse une LLE selon la procédure de que nous avons optimisé. Après reconstitution, ces standards sont conservés à +4°C.

Les spectres UV de toutes les molécules étudiées obtenus soit à partir des monographies du Clarke’s 2011  ou d’autres références, sont rassemblés dans un document pour faciliter leur identification après séparation

Procédure de traitement des échantillons biologiques

Pour le traitement des échantillons biologique nous avons choisi une procédure d’extraction liquide-liquide. En effet, cette technique d’extraction reste la plus utilisées dans le cadre du STA d’une part pour sa simplicité et ses rendements d’extraction convenables mais aussi pour la disponibilité des réactifs nécessaires à sa réalisation  et son coût raisonnable (Pragst,2004).

La procédure d’extraction que nous avons utilisée est basée sur celle établie par Saint-Marcoux et al. avec certaines modifications.

  • Phase organique d’extraction 

La phase d’extraction est un mélange de solvant dichlorométhane / heptane / isopropanol (60:26:14  v/v/v)  où le dichlorométhane, reconnu comme étant un  bon solvant extractif, remplace le monocholorométhane non disponible.

  • Tampon Chlorure d’ammonium à pH 9,5 

La préparation du tampon de chlorure d’ammonium selon la pharmacopée européenne se fait comme suit :

  • Dans une fiole de 250 ml, dissoudre 33.5g de chlorure d’ammonium dans 150 ml d’eau distillée
  • Ajouter 42 ml d’ammoniaque et bien agiter
  • Compléter au trait de jauge par de l’eau distillée
  • Vérifier le pH et ajuster à une valeur de 9,5 grâce à de l’acide chlorhydrique.
  • Conserver à +4°C et vérifier le pH avant chaque utilisation.

Procédure d’extraction 

  • Dans un tube en verre de 10 ml  introduire : 1ml de sérum + 1ml de tampon chlorure d’ammonium + 20µl de la solution de travail d’étalon interne.
  • Agiter au vortex quelques secondes
  • Ajouter 8 ml de la phase organique d’extraction
  • Extraction par rotateur pendant 10 min
  • Centrifuger à 3000tr /mn pendant 3 mn
  • Aspirer la phase aqueuse supérieure
  • Transvaser dans un autre tube de 10 ml et évaporer sous azote à 40°C
  • Récupérer le résidu d’évaporation par 200 µl d’un mélange eau-méthanol  (50:50 v/v) et bien agiter au vortex.
  • Transvaser dans un ependorff et centrifuger à 13000 tours/min pendant 10 min
  • Injecter 50 µl du surnagent.

Les modifications que nous avons réalisées sont les suivantes :

  • On introduit 1ml de tampon chlorure d’ammonium car après plusieurs essais confirmés les rendements d’extraction s’avèrent plus élevés pour plusieurs molécules.
  • Le résidu d’évaporation est repris selon Saint-Marcoux et al. par 50µl de mélange eau/méthanol pour un volume initial de sérum de 0,5 ml. Dans notre méthode, ce volume de reprise est insuffisant car la boucle d’injection est de 50 µl et un volume largement plus élevé doit être utilisé pour assurer son remplissage. De plus le résidu repris avec ce volume est très trouble, rendant impossible son injection directe. On décide alors dans un premier temps de doubler le volume initial de sérum afin d’utiliser 100µl du mélange pour la reprise du résidu. Mais ce volume reste insuffisant car le résidu ainsi repris est trouble malgré une bonne centrifugation. De ce fait et afin d’obtenir un surnageant limpide apte à être injecter, on opte pour un volume final de 200µl du mélange eau/méthanol pour la reprise du résidu sec d’évaporation.

Figure 4: Matériel utilisé pour la procédure de LLE au laboratoire de Toxicologie

Détermination du rendement d’extraction liquide-liquide

Une fois la procédure d’extraction choisie et optimisée et connaissant les TR obtenus par notre méthode, des mixtures ont été préparées en surchargeant des sérums blancs frais afin de calculer le rendement d’extraction. La composition des mixtures était déterminée en se basant sur les données de rétentions précédentes et en accordant la priorité pour les molécules les plus fréquemment utilisées.

Au final, 5 mixtures de 14 molécules (tableau.8) ont été préparées en surchargeant      1 ml de sérum à partir des solutions stocks d’étalons de sorte à obtenir une concentration de   10 mg/l pour chaque molécule. Pour cela, on retire 140µl du sérum qu’on remplace par 10 µl de chaque solution stock des 14 molécules qui composent la mixture.

Pour chaque mixture, le sérum ainsi obtenu subit une LLE puis une analyse chromatographique dans le but de déterminer la surface de chaque pic séparé

Tableau 8  Composition des mixtures utilisées pour le calcul du rendement d’extraction

Mixture Molécules
Mixture 1’ Isoniazide, Salbutamol, olanzapine, oxytetracycline, Acebutolol, alfuzocine, prednisone, haloperidol, métronidazole, dextropropoxyphene, griséofulvine, gliclazide, rifampicine, Ibuprofen
Mixture 2’ Metformine, Atenolol, Paracetamol, Doxilamine, Ropinirol, Fluconazole, Dapsone, Doxycycline, Dihydro-ergotamine, Ramipril, Clorazépate, Fexofenadine, Chlorpromazine, Valsartan
Mixture 3’ Codeine, Cocaine, Lamotrigine, Aspirine, Ketotifene , Piroxicam, Carvedilol, Amlodipine, Trimipramine, Loratadine, Spironolactone, Miconazole, Glimeperide, fussidate de sodium
Mixture 4’ Aciclovir, Ranitidine, MTX, Hydrocortisone, Atropine, Respiridone, Omeprazole, Lansoprazole, Furosemide, Paroxétine, Amitriptylline, Nystatine, kétoprofene, Amiodarone
Mixture 5’ Pyrazinamide, Sulpiride, Pseudoephedrine, Trimethoprime, Captopril, Pentoxifillyne, Sulfamethoxazol, Propranolol, Flecainide, Ketoconazole, Levomepromazine, MPA, Naproxéne, Clopidogrel

En parallèle, le même sérum blanc subit une LLE et après évaporation de la phase organique d’extraction on ajoute 14×10 µl des mêmes solutions stock. La mixture étant un mélange de solutions méthanoliques, une autre évaporation sous flux d’azote est réalisée puis le résidu est repris par 200 µl du mélange eau/méthanol (50 :50 v/v) et agiter au vortex. Après centrifugation, 50 µl du surnageant sont injectés et analysés et les surfaces des pics enregistrées. Le calcul du rendement d’extraction se fait grâce à la formule suivante :

Détermination des limites de détection

La limite de détection de chaque molécule est calculée après extraction à une longueur d’onde de 210 nm selon la formule suivante :

LD = 3 . Hmax . [C] / H[C]

Où :   Hmax : Hauteur de la ligne de base (Bruit de fond).

[C] : Concentration introduite de la molécule.

H[C] : Hauteur du pic de la molécule à la concentration introduite.

Semi-quantification

Dans le cadre du STA, la calibration et la validation de la quantification ne peuvent être réalisée pour un large nombre de substances, mais une approche semi-quantitative est possible du fait de la grande stabilité dans le temps de toutes les mesures optiques et la proportionnalité relative entre la concentration et l’absorption UV (loi de Beer-Lambert)  (Pragst,2004).

Il existe deux approches différentes pour la semi-quantification pour le STA par HPLC-DAD. Dans notre méthode, nous avons choisi l’approche de la surface spécifique du pic à une longueur d’onde définie car elle est plus adaptée à l’urgence et les  surfaces spécifiques obtenues sont très reproductibles. Pour cela, la surface des pics obtenue à 210nm pour chaque molécule après extraction est enregistrée.

Source: Extrait du Mémoire « Screening Toxicologique » du Docteur Mélaine Souhila, Pharmacienne Spécialiste en Toxicologie.

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