Spectrophotométrie de fluorescence

La fluorescence moléculaire est un processus d’émission pendant lequel les électrons d’une molécules sont excitées par l’absorption d’un rayonnement électromagnétique. Les électrons excités retournent à l’état fondamental, émettant leur énergie excédentaire sous forme de photons.

Il y a plusieurs façons dont une molécule excitée peut émettre son énergie excédentaire et retourne à son état fondamental. Deux des plus importants de ces mécanismes sont la relaxation non radiative et la relaxation fluorescente.

La relaxation non radiative peut se produire par des collisions entre des molécules excitées et des molécules du solvant, en donnant un excès d’énergie aux molécules de solvant. Le cas où la relaxation produit une fluorescence, des bandes de radiation sont produites lorsque les molécules excitées se relâchent à plusieurs états d’énergie, qui sont très proches en niveau d’énergie et donc en longueur d’onde. La fluorescence se produit uniquement à partir du niveau vibratoire le plus bas d’un état électronique excité.

Note: les bandes de fluorescence moléculaire sont constituées en grande partie de lignes dont la longueur d’onde est plus longue (énergie plus faible) que la bande de rayonnement absorbée responsable de leur excitation. Ce passage à une plus grande longueur d’onde est parfois appelé le décalage de Stokes. Pour cette raison, le spectre d’absorption ou d’excitation et le spectre de fluorescence pour un composé apparaissent souvent comme des images miroir approximatives les unes des autres. La région la plus exploitée pour la technique de fluorescence est située entre 200 et 800 nm.

La spectrophotométrie de fluorescence est généralement la méthode de choix pour certaines analyses quantitatives, le cas échéant. Elle joue un rôle majeur dans l’analyse, en particulier la détermination des traces de contaminants dans notre environnement, les industries et les organismes, car pour ces composés, la spectrométrie de fluorescence donne une sensibilité élevée et une haute spécificité. La sélectivité des méthodes de fluorescence est supérieure à celle des méthodes d’absorption, car moins de substances fluorescent absorbent le rayonnement dans la région UV ou visible. De plus, la fluorescence est plus sélective car les spectres d’émission et d’absorption peuvent être obtenus.

La fluorescence est généralement aussi plus sensible que les méthodes d’absorption, car il est toujours plus facile de mesurer un signal fable sur un très faible bruit de fond que de mesurer une petite différence entre de grands signaux. Cependant, le phénomène de fluorescence lui-même est soumis à des contraintes plus rigoureuses sur la structure moléculaire que l’absorption.

De nombreux médicaments possèdent des efficacités quantiques (QE) assez élevées pour la fluorescence, telles que la quinine et le diéthylamide d’acide lysergique (LSD).

Figure. Emission de fluorescence

Nomenclature

Un terme utilisé en fluorescence est l’efficacité quantique (QE), décrite par le rendement quantique (c’est-à-dire le rapport du nombre de molécules qui fluorescent sur le nombre total de molécules excitées). Les molécules hautement fluorescentes peuvent avoir des rendements quantiques proches de l’unité.

Toutes les molécules absorbantes ont un potentiel de fluorescence. Elles le font si l’émission fluorescente se produit à un rythme plus élevé que la relaxation par des voies non radiatives. Le type de processus de relaxation dépend fortement de la structure moléculaire. Les composés qui contiennent des cycles aromatiques donnent l’émission de fluorescence la plus intense et la plus utile. La substitution sur un cycle aromatique provoque des décalages dans le spectre de longueur d’onde d’excitation et dans l’efficacité de la fluorescence. Les substituants tels que les groupes -NH₂ , -OH, -OCH₃ et -NHCH₃ améliorent souvent la fluorescence, tandis que -Cl, -Br, -I, -NO₂ ou -COOH sont des groupes électro-attracteurs qui peuvent conduire à une réduction complète de la fluorescence (par exemple, l’aniline fluorescente alors que le nitrobenzène ne l’est pas). Le groupement moléculaire responsable de la fluorescence est parfois décrit comme un fluorophore.

La fluorescence est particulièrement favorisée dans les molécules rigides, car la rigidité moléculaire réduit la désactivation par des processus non radiatifs (moins de vibrations internes). C’est aussi la raison pour laquelle certains agents chélatants organiques sont plus fluorescents lorsqu’ils sont complexés avec un ion métallique.

Lois de la spectrophotométrie de fluorescence

La puissance du rayonnement fluorescent I_f est proportionnelle à la puissance rayonnante du faisceau d’excitation absorbé par le système:

La constante K ‘dépend de l’efficacité quantique de la fluorescence. Pour relier I _f à la concentration molaire cde la molécule fluorescente, la loi de Beer peut être utilisée:

En remplaçant l’équation (21.7) par (21.6), nous obtenons:

Après expansion du terme exponentiel, et à condition que ε bc <0.05, on peut écrire:

ou à la constante I₀ :

Quenching et autres effets spéciaux

Lorsque la fluorescence d’une espèce est atténuée à la suite de sa réaction avec un analyte, le signal diminue. Cet effet est appelé Quenching (extinction de fluorescence) et peut être utilisé à des fins de quantification, principalement pour la détermination des anions. Le Quenching peut également être un effet indésirable dans le cas de l’oxygène dissous (voir plus loin).

En outre, si l’analyte est trop concentré, une auto-extinction peut se produire lorsque des molécules fluorescentes entrent en collision et perdent leur énergie d’excitation par transfert sans rayonnement. La courbe de fluorescence en fonction de la concentration peut avoir un maximum et montrer ensuite une diminution du pouvoir fluorescent avec une concentration croissante. Il est impératif dans les déterminations quantitatives d’être conscient de ce problème, car une puissance fluorescente donnée peut correspondre à deux valeurs de concentration.

Ainsi, un graphique du pouvoir de fluorescence d’une solution par rapport à la concentration de l’espèce émettrice devrait être linéaire à de faibles concentrations. Les facteurs limitant la linéarité ne sont pas seulement la concentration du soluté, mais aussi des facteurs tels que la fluorescence à blanc, l’extinction de fluorescence et l’absorbance du rayonnement d’excitation par le solvant.

Instrumentation

Les composants de base des instruments d’analyse pour la spectroscopie d’absorption et de fluorescence sont semblables en termes de fonction et de performances générales. La plupart des instruments spectroscopiques sont constitués de cinq composants: