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Les tests colorimétriques

Les  colorimétriques sont considérés comme le premier outil d’identification toxicologique présomptive utilisé par les toxicologues et les analystes afin d’identifier des médicaments et des poisons.

Les tests colorimétriques sont appliqués surtout sur des produits pharmaceutiques et des résidus et, dans une
moindre mesure, sur des fluides biologiques tels que le contenu gastrique, et les urines. Ils sont utilisés pour placer une substance inconnue dans une classe spécifique de composés ou éliminer les catégories ou classes de composés qui ne correspondent pas à la substance en question.

Relatif : Liste des tests colorimétriques utilisés en Toxicologie

Ces tests restent populaires pour de nombreuses raisons.

  • Ils sont simples à réaliser,
  • Une utilisation minimale de réactifs;
  • Peu coûteux et donnent des résultats qui peuvent être constatés par l’œil nu.
  • Leur utilisation est beaucoup plus intéressante en particulier dans les pays en développement où les installations de laboratoire ont tendance à être très limitée.

Dans de nombreux cas, ils peuvent également être utilisés parallèlement avec la Chromatographie sur couche mince (CCM), les réactifs sont appliqués par pulvérisation ou par trempage.

Spécificité

Pour certaines substances, la réaction colorée avec un réactif chimique particulier peut être tout à fait spécifique, mais il est beaucoup plus fréquent pour que la couleur soit produite par une classe de composés. En outre, des composés qui ne le font pas partie de la classe recherchée peuvent également donner des couleurs. Pour certains de ces tests, la couleur donnée peut être liée avec certains aspects de la structure chimique d’un composé ou groupe de composés. Cependant, les réponses anormales qui, souvent peuvent être produite, ne peuvent être expliquées sur cette base.

Les tests colorimétriques sont uniquement une indication de la présence d’un composé ou d’une classe de composés, et doivent être confirmés par des méthodes plus spécifiques.

Interprétation des tests colorimétriques

Descriptions de couleurs

Les couleurs émises par les tests colorimétriques ne peuvent pas être décrites avec précision. elles peuvent varier selon l’intensité, la teinture  ou  la concentration des composés dans les échantillons et selon aussi la présence de substances étrangères . De plus, leur évaluation est toujours subjective, même chez les personnes atteintes vision normale des couleurs. Certains des complexes formés sont instables, les colorations changent ou sont fugace ou fondent dans le temps.

Effets de la forme ionique

Les sels peuvent donner des couleurs différentes de celles de l’acide ou de base correspondants. En général, les toxiques ont été isolés à partir de l’échantillon par un procédé d’extraction sous leur forme acide libre ou basique, donnent de meilleurs  résultats par rapport à leurs sels. La couleur d’un sel peut être modifiée par la nature des autres ions présents. Par exemple, tous les chlorhydrates donnent une couleur rouge et une couleur bleue avec le réactif Koppanyi-Zwikker (avant d’ajouter pyrrolidine). Les sels basiques d’acides faibles peuvent produire des couleurs différentes en raison d’un changement dans un pH.

Si le composé a été extrait à partir d’un milieu biologique, ces facteurs ne devraient pas créer des difficultés, car il
sera présent sous la forme basique. Cependant, lors de l’application des tests à des préparations pharmaceutiques, où les composés sont généralement présents sous forme de sels, ce qui peut causer des problèmes. Pour remédier à cela, le matériau peut être extrait de la même façon que pour les échantillons biologiques proviennent de la base libre. Les sels de bromure ou iodure peuvent être convertis en nitrates avant l’essai, ce qui donne la même couleur de base par la méthode suivante :

  • A 0,5 ml d’une solution à 1% du sel dans de l’acide acétique dilué (p / v), ajouter une goutte de 8% (p / v) de solution de nitrate d’argent suivie d’une une goutte de 2% (p / v) de solution de chlorure de sodium pour éliminer l’excès d’argent (Ag).
  • Centrifuger pour séparer les halogénures d’argent précipités et utiliser le liquide surnageant, que ce soit sous forme de solution ou évaporée à sec si nécessaire, pour les tests colorimétriques.

Les couleurs qui sont enregistrés dans les tableaux et les monographies sont habituellement celles obtenues en testant soit l’acide libre ou la base libre.

Utilisation des tests colorimétriques

Le système adopté utilise dix couleurs de base: les couleurs spectrales (rouge, orange, jaune, vert, bleu et violet), avec rose, brun, gris et noir. Lorsqu’il y a une variation de teinte, cela est indiqué en combinant deux couleurs (par exemple rouge-brun). Le deuxième nom de la couleur est considéré comme l’un dominant et est la couleur principale utilisée dans les listes. Par exemple, rouge-brun est répertorié comme brun, tandis que brun-rouge est répertorié comme rouge. Lors de l’interprétation des résultats, il est souvent nécessaire de rechercher dans les listes données les deux couleurs principales (par exemple pour rouge-brun, les listes sous la fois rouge et brun devraient être  consultés).

Cette disposition tient compte de la nature subjective de l’évaluation de la couleur. Une flèche entre les deux couleurs (par exemple rouge→marron) indique que la couleur va subir des changements au cours de l’essai. La notation brun / rouge est utilisée là où il ya deux parties d’un test qui va produire deux couleurs.

Points pratiques

Effectuer des tests colorimétriques

Les essais sont effectués soit dans des tubes en verre ou bien des tubes à essai clairs ou blancs en porcelaine, de manière à ce qu’ils donnent un fond uniforme contre les couleurs évaluées. Pour les médicaments, les essais sont conçus pour travailler sur environ 1 mg,  de la forme solide ou la forme d’extrait sec (voir ci-dessous), sauf indication contraire. Les solutés devraient être dans l’eau, sauf indication contraire. Lorsqu’une instruction, le temps, la température, etc., apparaît entre parenthèses après le nom du médicament, tels que (ajoutez de l’eau), (15 s) ou (lentement à 100° C), ce qui indique une modification de la procédure de test pour ce médicament particulier.

Recommandations importantes

  • Un échantillon qui ne contient pas le composé d’intérêt (blanc) devrait être testé en même temps que l’échantillon à tester. Cela permet une comparaison des couleurs produites par l’échantillon et par le réactif à blanc. Idéalement, l’échantillon à blanc doit être dans la même matrice que l’échantillon à tester (par exemple pour les tests d’urine utiliser l’urine analyte-libre), car cela prend compte des effets de matières étrangères. Sinon, l’eau est généralement adéquate.
  • Avant de prendre une décision finale sur le résultat d’un test, la réaction de l’inconnu doit être comparée à celle d’une substance de référence testée exactement dans les mêmes conditions.

Validation d’un test colorimétrique

Il est essentiel de valider tous les tests et réactifs en termes de sensibilité et de spécificité; O’Neal et al. (2000) ont décrit une méthode appropriée.

Application des tests colorimétriques sur les extraits d’échantillons

Plusieurs systèmes d’extraction par solvant ont été conçus pour séparer les substances chimiques sur la base de leurs caractéristiques acides, neutres ou basiques. Les essais énumérés dans le tableau suivant peuvent être appliqués sur les extraits après évaporation.

Tests pouvant être appliqués sur des extraits après évaporation
Fraction Test
Acide fort aromaticitéchlorure ferriqueRéactif de Folin-Ciocaltaeu

Le réactif de Liebermann

Le réactif de Millon

Le réactif de Nessler

Acide faible aromaticitéalcool coniféryliquediazotation

chlorure ferrique

Réactif de Folin-Ciocaltaeu

Réactif Koppanyi-Zwikker

Le réactif de Liebermann

nitrate de mercure

Le réactif de Millon

Le réactif de Nessler

Neutre aromaticitéfurfuraldéhydeRéactif Koppanyi-Zwikker

Le réactif de Liebermann

nitrate de mercure

Le réactif de Nessler

Basic Test à l’acide Amalicp-diméthylaminobenzaldéhydechlorure ferrique

Acide sulfurique formaldéhyde

réactif Forrest

réactif FPN

Le réactif de Liebermann

Le réactif de Mandelin

réactif Marquis

Le réactif de Nessler

Acide sulfurique

Le Tableau suivant donne un aperçu rapide des tests qui peuvent être appliqués pour identifier les groupes les plus importants de la substance à analyser.

Tableau 30.2 Indication des tests peuvent être appliquées pour détecter certainsgroupes de médicaments et d’autres poisons les plus important
Substance/ Groupe fonctionnel Test
Alcools Dichromate de potassium
Les alcaloïdes et les bases azotées réactifs de Dragendorff
Amides (aliphatiques) réactif de Nessler
Les aldéhydes (aliphatiques) réactif de Schiff
Amphétamines Voir annexe 30.1 Le nitroprussiate de sodium et d’acétone
Antidépresseurs Test de Marquis
Barbituriques Réactif de Dille-KoppanyiRéactif Koppanyi-ZwikkerNitrate de mercure

Réactif de vanilline

Réactif de Zwikker

Benzodiazépines L’acide sulfurique – formaldéhyde
Cannabis Réactif  de Duquenois
Carbamates (non aromatique) Furfural
Cocaïne Cobalt thiocyanatep-diméthylaminobenzaldéhydeLe test de Mandelin

Le test de Scott

Phénols chlorés Acide nitrique (fumant)
Hydrocarbure chloré L’acide nitrique – acide sulfurique
Cyanide Sulfate ferreux (B)Picrate de sodium
Groupes cyanure Picrate de sodium
Dithiocarbamates Nitroprussiate de Sodium
Alcaloïdes de l’ergot p-Diméthylaminobenzaldéhyde
Hydrocarbures halogénés test de Fujiwara
Imides Test de Koppanyi-Zwikker
Cétones Nitroprussiate de Sodium
La méthadone Cobalt thiocyanateLe test de MandelinTest Marquis

Ester  Tetrabromophénolphthaléine éthylique

Anneau mono-substitué  de Pyridine bromure de cyanogène
Nitrates et les nitrites Sulfate ferreux
Opiacés Annexe 30.2
Agents oxydants Diphénylamine
Paraquat / diquat Dithionite de sodium
Phencyclidine Cobalt thiocyanatep-diméthylaminobenzaldéhydeEster  Tetrabromophénolphthaléine éthylique

 

Phénols p-diméthylaminobenzaldéhydeChlorure ferriqueRéactif de Folin-Ciocaltaeu

Réactif de Millon

Phénothiazines Chlorure ferriqueAcide sulfurique – formaldéhydeRéactif Forrest

Réactif FPN

 

Phenylpyrazolines Acide nitreux
Amines aromatiques primaires Alcool coniféryliqueDiazotation
Amines primaires secondaires Réactif de DragendorffTest de Simon
Propoxyphène Cobalt thiocyanateRéactif de FroehdeTest de Liebermann

Ester Tetrabromophénolphthaléine éthylique

Ammonium quaternaire Ester Tetrabromophénolphthaléine éthylique
Amines Quaternaires Réactif de Dragendorff
Quinines Cobalt thiocyanateThalleioquine
Quinones Hydroxyde de potassium méthanolique
Agents réducteurs Réactif de Benedict
Salicylates Chlorure ferriqueRéactif de Trinder
Stéroïdes Pentachlorure d’antimoineAcide sulfurique –  NaphtholAcide sulfurique
Sulfamides Sulfate de cuivreRéactif Koppanyi-ZwikkerNitrate de mercure

Acide nitreux

Substances contenant le soufre Chlorure de palladiumNitroprussiate de sodium
Amines tertiaires Réactif de DragendorffEster Tetrabromophénolphthaléine éthylique

les réactions colorées données par les stupéfiants et les amphétamines avec les réactifs des alcaloïdes (Marquis, Mecke, Froedges et de Mandelin) figurent dans l’annexe 30.1 et Annexe 30.2. Trois essais colorimétriques ont été développés pour l’acide gamma-hydroxybutyrique (GHB) et son précurseur gamma-butyrolactone (GBL; voir Annexe 30.3).

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