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Traitement des données et présentation des résultats de la Spectrophotométrie

Lorsque seulement un composant dans l’échantillon absorbe de manière significative, la longueur d’onde est choisie pour coïncider avec le centre d’un large maximum dans le spectre pour minimiser les erreurs de réglage de longueur d’onde. Si le spectre n’a pas de maximum approprié, un minimum d’absorption plat peut être utilisé, à condition que la perte de sensibilité qui en résulte soit acceptable. Les longueurs d’onde proches des extrémités des plages UV et visible doivent être évitées, ceci est à cause des effets de lumière parasite.

Les mesures précises d’un médicament en solution peuvent être difficiles en raison de l’absorption non spécifique. Dans ces conditions, la correction géométrique imaginée par Morton et Stubbs est parfois appliquée. Cela suppose que l’absorption non spécifique varie linéairement avec la longueur d’onde sur la plage mesurée. En prenant une solution de médicament pur, deux points équi-absorbants sont sélectionnés, l’un à une longueur d’onde inférieure (λ1) et l’autre à une longueur d’onde supérieure (λ3) à celle du maximum de crête (λ2). Toute absorption non pertinente dans l’échantillon augmente l’absorbance observée d’un point équiabsorptif (habituellement λ1) plus que l’autre (λ3). Un calcul géométrique simple impliquant des absorbances à λ1 et λ3 permet de corriger l’absorbance à λ2 pour l’absorption non spécifique (Donbrow 1967). L’hypothèse de linéarité de l’absorption non pertinente peut être testée en soustrayant la courbe théorique de la quantité calculée de matériau pur et en inspectant le spectre de différence résiduelle.

L’exemple classique d’un essai de pharmacopée basé sur la correction de Morton-Stubbs est celui de l’alcool, de vitamine A et de l’ester (Stationery Office 2002, page 1783). D’autres techniques proposées pour la correction de l’absorption non spécifique comprennent la spectrophotométrie de différence, la spectrophotométrie du second dérivé, l’utilisation de polynômes orthogonaux et la transformation chimique ou physique du médicament pour donner une absorption à une longueur d’onde plus grande.

Systèmes multicomposants

Les spectres d’absorption de deux médicaments ou plus d’intérêt thérapeutique se chevauchent souvent. Sous réserve de certaines conditions, la méthode de Vierordt des équations simultanées peut être employée pour obtenir les concentrations individuelles (Glenn 1960). Si chacun des n médicaments obéit à la loi de Beer-Lambert sur la gamme de concentration d’intérêt, et si la loi d’additivité des absorbances s’applique, alors l’absorbance totale, AλT, observée à toute longueur d’onde λ est donnée par la somme:

où l’indice i désigne chaque composant du système. Le terme kλii représente l’absorptivité a (L/g/cm), l’absorbance spécifique (A1%1cm),ou l’absorptivité molaire ε (L/mol/cm), déterminé par les unités sélectionnées pour la concentration ci.

Pour un système à deux composants, deux longueurs d’onde λ1 et λ2 sont sélectionnées (comme indiqué ci-dessous) et deux équations simultanées correspondantes:

Le choix des longueurs d’onde appropriées et l’utilisation de valeurs d’absorptivité précises sont clairement cruciaux. En général, λ1 est le λmax pour le composant 1, tandis que λ2 est le λmax pour le composant 2, à condition qu’à ces longueurs d’onde la capacité d’absorption du composant chevauchant soit faible. Si les spectres des deux composants sont très similaires, les erreurs de la méthode augmentent sensiblement puisque la différence entre les rapports d’absorptivité tend vers zéro.

Bien que cette méthode doive s’appliquer à l’analyse de trois composants ou plus, dans la pratique, il est souvent difficile de sélectionner des longueurs d’onde qui remplissent toutes les conditions requises. Cependant, les spectrophotomètres assistés par ordinateur exploitent le «principe de surdétermination», dans lequel le nombre ( m ) de longueurs d’onde d’observation dépasse le nombre ( n ) de composants connus pour être présents. Cela donne une matrice de données n × m qui peut être facilement résolue par l’algèbre matricielle standard.

Le test limite de l’amphotéricine A (un tétraène, λmax 300 nm) dans l’antibiotique antifongique amphotéricine (constitué principalement d’amphotéricine B, d’un heptaène, λmax 380 nm) est un exemple d’une telle analyse à deux composants (Stationery Office 2002, page 129).

Spectrophotométrie de différence

La spectrophotométrie différentielle est une méthode de compensation de la présence de matières étrangères dans un échantillon qui pourrait autrement interférer avec le spectre du médicament à déterminer. Elle implique la mesure de la différence d’absorbance, à une longueur d’onde définie, entre deux échantillons dans l’un desquels une propriété physique ou chimique du médicament a été changée. On suppose que le spectre du médicament peut être modifié sans affecter le spectre du matériau interférant. En variante, la différence d’absorbance peut être mesurée entre l’échantillon et une solution équivalente sans le médicament. La spectrophotométrie différentielle est parfois appelée «spectrophotométrie différentielle», mais ce terme n’est pas recommandé en raison de sa confusion possible avec la spectrophotométrie dérivée.

De nombreuses méthodes appropriées de modification physique et chimique de l’absorbance du médicament ont été rapportées. Par exemple, l’effet bathochrome (également discuté plus tard) est utilisé dans le dosage spectrophotométrique de différence des barbituriques. L’absorbance de l’échantillon à environ pH 10 ( A10 ), à laquelle contribue l’espèce mono-anionique ( AB ), est utilisée pour compenser l’absorption des matériaux endogènes interférents ( AM ) qui ont été transportés à travers la procédure d’extraction . L’absorbance de l’échantillon à pH 13 ( A13 ), à laquelle contribue l’espèce dianionique ( AD ), est mesurée à environ 260 nm en référence à l’absorbance de l’échantillon à pH 10 ( A10 ), de sorte que:

Ainsi:

Si:

Alors:

Ainsi, l’absorbance des différences peut être facilement reliée à la concentration par étalonnage préalable de la constante Δ ε , ou la concentration peut être trouvée par une simple proportion:

Il faudrait cependant établir que A A est une fonction linéaire de la concentration ( c ) sur la gamme requise. Il est commode de sélectionner pour la longueur d’onde analytique une valeur qui correspond à un maximum dans le spectre de différence, obtenue en balayant l’échantillon et la solution de référence sur une gamme de longueur d’onde appropriée.
La spectrophotométrie de différence peut être utilisée pour le contrôle de la qualité dans les cas où le matériau interférant est bien défini, car une dilution appropriée d’une solution de référence appropriée peut être utilisée dans la cellule de référence. L’absorbance des différences est cependant susceptible d’une erreur systématique lorsqu’il existe une incertitude sur la concentration des matériaux interférents dans les échantillons à doser.Cette erreur augmente proportionnellement au rapport de l’absorptivité molaire de l’interférence à celle du médicament.

Une autre technique pour corriger les interférences absorbantes par mesure de différence est basée sur la spectrophotométrie à deux longueurs d’onde . Dans cette méthode, deux faisceaux monochromatiques à différentes longueurs d’onde sont passés à travers le même échantillon. Une longueur d’onde ( λ1 ) est généralement caractéristique du médicament, tandis que l’autre ( λ2 ) est choisie avec soin pour que l’absorbance soit équivalente au niveau d’interférence absorbante ( Aλm ) anticipé à la longueur d’onde analytique ( λ1 ). Ainsi, le deuxième faisceau de rayonnement est analogue à la cellule de référence utilisée en spectrophotométrie différentielle classique, et la différence d’absorbance aux deux longueurs d’onde ( A A ) représente l’absorption du médicament ( Aλm ) corrigé pour l’interférence:

Une application classique de cette méthode est la correction de la diffusion de Rayleigh dans des échantillons d’origine biologique.

Spectrophotométrie dérivée

En spectrophotométrie dérivée, l’absorbance ( A ) d’un échantillon est différenciée par rapport à la longueur d’onde ( λ ) pour générer les dérivées de premier, second ou d’ordre supérieur:

A = f ( λ ), ordre zéro

A / d λ = f ‘( λ ), première dérivée

2A / d λ2 = f “( λ ), dérivée seconde

etc.

Les spectres dérivés donnent souvent un profil caractéristique, dans lequel des changements subtils de gradient et de courbure dans le spectre normal (ordre zéro) sont observés comme caractéristiques bipolaires distinctives. La première dérivée d’un spectre d’absorption représente le gradient à tous les points du spectre et peut être utilisée pour localiser les pics «cachés», puisque dA / d λ = 0 au maximum de pic. Cependant, les dérivées de second rang et d’ordre plus élevé sont potentiellement plus utiles dans l’analyse.

Les dérivées d’ordre pair sont des fonctions bipolaires de signe alterné au centroïde (ie négatif pour 2nd, positif pour 4ème, etc.), dont la position coïncide avec celle du maximum de crête d’origine. Dans cette mesure, les spectres à dérivées paires ont une similarité avec le spectre original, bien que la présence de pics satellites qui flanquent le centroïde ajoute un degré de complexité au profil dérivé. Une caractéristique clé est que la largeur de pic du centroïde dérivé d’un pic gaussien diminue à 53%, 41% et 34% de la largeur de pic d’origine, dans les deuxième, quatrième et sixième ordres, respectivement. Cette fonctionnalité peut augmenter la résolution des pics qui se chevauchent. Cependant, les modèles satellites de plus en plus complexes nuisent à l’amélioration de la résolution dans les spectres dérivés plus élevés.

Une propriété importante du processus dérivé est que les bandes larges sont supprimées par rapport aux bandes pointues. Cet effet augmente avec l’ordre croissant de la dérivée, puisque l’amplitude ( Dn ) d’un pic gaussien dans la nième dérivée est inversement proportionnelle à la largeur de pic originale ( W ), portée au nième degré:

Ainsi, pour deux pics coïncidents d’intensité égale, la nième amplitude de la dérivée du pic plus net ( x ) est supérieure à celle du pic plus large ( y ) d’un facteur qui augmente avec l’ordre de la dérivée:

Cette propriété conduit à la réjection sélective de larges interférences spectrales additives, telles que la diffusion de Rayleigh.

Si la loi Beer-Lambert est respectée, c’est:

Et de même pour les dérivés supérieurs, où ε est l’absorptivité molaire (L / mol / cm), b la longueur du trajet cellulaire (cm) et c la concentration (mol / L).

Pour un travail quantitatif, l’amplitude d’un pic dérivé peut être mesurée de diverses manières. Bien que l’amplitude réelle dérivée soit celle mesurée par rapport au zéro dérivé, la pratique la plus courante consiste à enregistrer l’amplitude par rapport à un satellite dans le spectre, ce qui permet un degré supplémentaire de suppression des interférences provenant de substances étrangères. Il est essentiel d’exécuter des étalons en séquence de bracketing avec les échantillons, et donc de les soumettre aux mêmes conditions expérimentales.Il doit être établi que le dérivé graphique adopté répond aux critères analytiques de la réponse linéaire avec concentration, régression à travers ou proche de l’origine, indépendance vis-à-vis des substances interférentes et précision optimale.

En général, les méthodes de génération de spectres dérivés appartiennent à deux classes. Ce sont des méthodes optiques, qui fonctionnent sur le faisceau de rayonnement lui-même, et des méthodes électroniques ou numériques, qui fonctionnent sur la sortie du détecteur photométrique. Le dispositif analogique électronique génère la dérivée requise en fonction du temps lorsque le spectre est balayé à vitesse constante (d λ / d t ), et donc l’amplitude de la dérivée varie avec la vitesse de balayage, la largeur de la fente et le gain. De plus, il a été rapporté que le rapport signal / bruit se dégradait d’environ un facteur deux dans chaque ordre dérivé successif.

En variante, un micro-ordinateur, utilisant l’un d’un certain nombre d’algorithmes numériques, peut être utilisé pour produire des spectres dérivés lissés. Ceci est effectué en temps réel ou par traitement post-run du spectre numérisé. L’approche numérique est couramment utilisée dans les spectrophotomètres contemporains, en raison de l’adoption généralisée des microprocesseurs pour le contrôle des instruments et le traitement des données, associée à l’ajout de puissants logiciels pour le traitement ultérieur des données.

Bien que la transformation d’un spectre en son dérivé de second ordre ou d’ordre supérieur donne souvent un profil plus hautement caractéristique que le spectre d’ordre zéro, le contenu d’information intrinsèque des données n’est pas augmenté; en effet, certaines données, telles que les facteurs ‘offset’ constants, sont perdues. Cependant, la méthode dérivée a tendance à mettre en évidence des caractéristiques spectrales subtiles en les présentant d’une manière nouvelle et visuellement plus accessible. La méthode est généralement applicable en chimie analytique et peut être utilisée également pour améliorer la résolution de données d’analyse électrochimique, chromatographique ou thermique.

La spectrophotométrie dérivée a trouvé une application significative dans l’analyse clinique, médico-légale et biomédicale (Gill et al., 1982). En toxicologie médico-légale, la suppression de l’absorbance des substances interférentes par spectrophotométrie du second dérivé est bien démontrée dans les études sur l’amfétamine dans un extrait de foie homogénéisé. La transformation du spectre d’ordre zéro (A) en sa seconde dérivée (B) à l’aide d’un spectrophotomètre multicanal à balayage rapide permet de détecter les pics benzénoïdes caractéristiques de l’amphétamine et de les comparer à un standard authentique (D), tandis que l’absorption interférentielle est réduit sensiblement. La deuxième et la quatrième méthode dérivée pour la correction de fond biologique peuvent multiplier par dix la limite de détection du paraquat sérique en cas d’empoisonnement (Fell et al., 1981). La méthode dérivée peut être combinée avec succès avec la spectrophotométrie de différence, pour donner des spectres de différence de second dérivée, dans lesquels une discrimination accrue contre les substances interférentes et des caractéristiques structurelles fines affûtées sont observées.

Fluorimétrie analytique

Les propriétés de fluorescence d’un composé sont caractérisées par deux spectres. Un spectre d’excitation est obtenu en surveillant la fluorescence à une longueur d’onde fixe appropriée λf , tout en balayant le monochromateur d’excitation à une vitesse fixe jusqu’à une longueur d’onde non supérieure à λf . Le spectre d’excitation devrait, en principe, être comparable au spectre d’absorption. Le spectre de fluorescence est obtenu en éclairant l’échantillon à une longueur d’onde d’excitation fixe appropriée λex et en balayant le monochromateur d’émission à une vitesse fixe sur une plage de longueur d’onde non inférieure à λex . Pour les comparaisons interlaboratoires, les spectres corrigés de fluorescence et d’excitation devraient être obtenus en utilisant l’une des techniques numériques ou instrumentales généralement disponibles.

Certains spectrofluorimètres sont capables de balayer les monochromateurs d’excitation et d’émission de manière synchrone pour obtenir des spectres de fluorescence, qui sont généralement plus simples et nettement plus nets que le spectre de fluorescence conventionnel. Avec la spectrofluorimétrie assistée par ordinateur, l’acquisition et le stockage numérique des spectres de fluorescence sont possibles. Ceux-ci peuvent ensuite être manipulés de diverses manières pour donner au spectre dérivé dans lequel la structure fine est accentuée, le spectre de différence, ou la déconvolution spectrale multi-longueur d’onde, pour calculer la concentration des composants chevauchants connus (Winfield et al.

Dans une autre technique numérique, une série de spectres de fluorescence est acquise tout en étendant séquentiellement la longueur d’onde d’excitation. Lorsque ces spectres sont combinés pour donner une matrice de ( If , λf , λex ), une projection isométrique tridimensionnelle est présentée. Ce type de présentation graphique est décrit comme une «matrice d’excitation-émission» ou un «fluorogramme». Les données peuvent également être tracées en tant que tracé bidimensionnel équivalent des contours d’isointensité dans le plan ( λfλex ). Les graphiques tridimensionnels sont de plus en plus utilisés pour la comparaison qualitative des molécules fluorescentes, comme dans l’exemple de la prométhazine et de son principal produit de dégradation, le prométhazine sulfoxyde.

Vérifications de performance de l’instrument

Alors que les instruments avec optique conventionnelle peuvent nécessiter un calibrage fréquent car ils comportent de nombreuses pièces mobiles, les spectrophotomètres à barrettes de diodes sans pièces mobiles sont extrêmement reproductibles et stables, à court et à long terme.

Conformément aux recommandations de la Pharmacopée Européenne (Conseil de l’Europe 2002) pour la spectrophotométrie UV et visible, la longueur d’onde et l’absorbance doivent être étalonnées. L’échelle de longueur d’onde doit être vérifiée en utilisant les maxima d’absorption de la solution de perchlorate d’holmium, la ligne d’une lampe à décharge d’hydrogène ou de deutérium ou les lignes d’une lampe à vapeur de mercure.La tolérance admise est de ± 1 nm pour la plage UV et ± 3 nm pour la plage visible. L’absorbance doit être vérifiée à l’aide de filtres appropriés ou d’une solution de dichromate de potassium à 60 mg / L dans de l’acide sulfurique à 0,005 M aux longueurs d’onde indiquées dans le tableau suivant:

Longueur d’onde (nm) Absorption spécifique ( A11 ) Tolérance maximale
235 124.5 122.9-126.2
257 144.5 142,8-146,2
313 48,6 47,0-50,3
350 107,3 105.6-109.0

Le niveau de lumière parasite doit être évalué, car il augmente avec l’âge de l’instrument. Il peut être détecté à une longueur d’onde donnée avec des filtres appropriés ou une solution de chlorure de potassium à 1,2% p / v.La pharmacopée européenne (Conseil de l’Europe 2002) exige que l’absorbance soit supérieure à deux à une longueur d’onde comprise entre 198 et 202 nm par rapport à l’eau comme liquide de compensation.

Dans certains tests, il est nécessaire de spécifier la résolution minimale souhaitable, car des changements dans la largeur de bande spectrale (ou largeur de fente du monochromateur) peuvent sérieusement affecter l’absorbance observée des pics pointus. La Pharmacopée européenne (Conseil de l’Europe 2002) exige que la bande passante spectrale utilisée soit telle qu’une réduction supplémentaire n’entraîne pas d’augmentation de l’absorbance mesurée. Ceci est particulièrement important pour les médicaments qui ont des systèmes aromatiques ou fortement conjugués (par exemple la diphénhydramine, la phénoxyméthylpénicilline et l’amphotéricine A et B). Dans de tels cas, une bande passante spectrale de plus de 1 nm entraîne une réduction de l’absorbance observée au maximum de crête (et inversement une augmentation de l’absorbance à un minimum de crête), puisque l’absorbance enregistrée est la moyenne sur toute la bande passante cette longueur d’onde. Bien que l’augmentation de la largeur de fente donne un meilleur rapport signal / bruit, une largeur de fente de 2 nm est adéquate pour la plupart des bandes, avec 1 nm ou 0,5 nm étant utilisé pour des pics très nets.

Pour l’analyse qualitative, la résolution peut être mesurée en enregistrant le spectre d’une solution à 0,02% de toluène dans l’hexane. Le rapport minimum entre l’absorbance maximale à 269 nm et le minimum à 266 nm est indiqué dans les monographies de la Pharmacopée européenne (Conseil de l’Europe 2002).

Selon les principes de bonnes pratiques de laboratoire ( BPL ), l’appareil doit être inspecté périodiquement, nettoyé, entretenu et calibré conformément aux procédures d’utilisation normalisées du laboratoire. Les enregistrements des procédures doivent être conservés. Le calibrage devrait, le cas échéant, être traçable aux étalons de mesure nationaux ou internationaux.

Des exemples d’options intéressantes sur le système sont une base de données de journaux de bord dans laquelle les changements de lampe et les défauts sont enregistrés. En outre, une fonction de verrouillage de clé est maintenant une partie commune d’un système de qualité pour éviter les effets des frappes non désirées.

En fluorescence, le calibrage des longueurs d’onde des monochromateurs d’excitation et d’émission doit être vérifié régulièrement à l’aide de lignes pointues provenant de la propre source de rayonnement de l’instrument (par exemple lignes de xénon à 450,1, 462,4, 467,1 et 473,4 nm). des verres d’ions lanthanides trivalents (Te, Eu). D’autres étalons de fluorescence couramment utilisés sont l’ovulène et d’autres hydrocarbures aromatiques polycycliques avec de fines structures vibrationnelles telles que le naphtalène et l’anthracène. En pratique, il suffit de calibrer un monochromateur, puisque l’autre peut alors être étalonné par le rayonnement diffusé de Rayleigh en utilisant un échantillon de silice colloïdale dans la position de l’échantillon. L’utilisation d’une source de lumière auxiliaire, telle qu’un stylo à lumière au mercure, est la méthode la moins satisfaisante pour l’étalonnage de la longueur d’onde.

Il est recommandé que la performance de chaque système informatisé soit vérifiée pour le bon fonctionnement de l’acquisition des données, de l’étalonnage et des rapports liés à la méthode. Habituellement, les emballages de test sont disponibles dans le commerce auprès du fournisseur.

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