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Mesure de l’activité cholinestérasique

On a expérimentalement montré (in vitro et in vivo, sur le rat) que certains polluants ont des effets perturbateurs qui peuvent être antagonistes (zinc qui a un effet inhibiteur et cadmium qui est un activateur par exemple) sur les activités cholinestérasiques (totale, vraie et pseudo) pour différents tissus du rat (sang, cerveau, cœur, foie, rate et rein). Cet effet cholinestérasique est vérifié pour les intoxications immédiates, mais n’est pas observé lors d’exposition chronique à de faibles doses.

Mesure de l’activité cholinestérasique

Principe

Certains insecticides comme les organo-phosphorés ou les carbamates sont des inhibiteurs de la cholinestérase qui est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse de l’acétylcholine en acide acétique et choline.

Au laboratoire, l’activité cholinestérasique est évaluée en mesurant la variation de pH due à la libération de l’acide acétique à partir du substrat « acétyl-choline » pendant un temps déterminé.

Matériel et réactifs

  1. Eau distillée exempte de CO2 (Sans CO2) faire bouillir 500 ml d’eau distillée pendant 10mn et la laisser à l’abri de l’air. Cette eau servira à la préparation des réactifs 1 et 2.
  2. Réatif 1: Solution de Bleu de Bromothymol (B.B.T)
  • Bleu de Bromothymol…………………………100mg
  • NaOH 0,05 N………………….…………………..3,2 ml
  • Eau distillée exempte de CO2 ……………..100ml

Vider les tubes du contenu de B.B.T et du NaOH dans une fiole de 100 ml et la remplir à moitié avec de l’eau distillée exempte de CO2 Boucher tout de suite la fiole. Mélanger légèrement et la laisser reposer 1heure.

Ensuite compléter avec l’eau distillée exempte de CO2 jusqu’à 100ml. Cette solution peut se conserver plusieurs mois à l’abris de la lumière et de la chaleur.

  1. Réactif 2: Solution de substrat
  • Chlorhydrate d’acétylcholine …………….une pincée
  • Eau distillée exempte de CO2……….……50 ml

Remplir l’extrémité de la spatule de substrat (le chlorhydrate d’acétylcholine). L’introduire dans le flacon marqué ” substrat”

Ajouter 50 ml d’eau distillée exempte de CO2.

La solution de substrat doit être préparée chaque jour. Il faut la déposer à l’abri de la chaleur.

Mode opératoire

  • Suivant le nombre de personnes qui seront soumises à l’évaluation de l’activité cholinestérasique, prendre une série de petits tubes du kit lovibond mis à votre disposition. Numéroter les 2 premiers tubes de la façon suivante:
  • 1er tube: Témoin Blanc (T.B)
  • 2ème tube : Témoin Réaction (T.R)
  • Les autres tubes serviront pour les personnes à tester.
  • La réaction se fera de la façon suivante:
Tube blanc (TB) Tube témoin (TR) Tubes personnes à tester
Sang du sujet non exposé au pesticide 10 µl 10 µl
Sang de la personne à tester
Eau distillée sans CO2 1 ml
Indicateur (BBT) 0.5 ml 0.5 ml

 

  • Bien mélanger le contenu de tube blanc avec la micropipette et le transférer dans la cuve de 2,5 mm. La placer dans le compartiment gauche du comparateur.
  • Les étapes ci-dessus doivent être exécutées à la minute près.
  • Ajouter 0,5 ml du substrat dans le tube témoin. boucher et mélanger par retournement. Transférer dans la cuve de 2,5 mm et le placer dans le compartiment droit du comparateur.
  • Noter l’heure à la minute près : c’est le temps zéro. Lire immédiatement dans le compartiment droit. Le résultat doit être inférieure ou égal à 12,5%.
  • A intervalle d’une minute, ajouter 0,5 ml de la solution de substrat dans le tubes “personnes à tester” en prenant la précaution de respecter l’intervalle de 1 minute entre les 2 tubes.
  • Attendre que l’échantillon contrôle atteigne 100% d’activité cholinestérasique en lisant contre l’échantillon blanc dans le compartiment gauche. Le temps d’incubation dépend de la température ambiante et varie en général entre 18 et 30 minutes.
  • Lire chaque échantillon des personnes à tester à 1 minute d’intervalle.
  • Noter le pourcentage d’activité cholinestérasique.

Méthode de VINCENT-SEGONZAC

Après réaction de l’enzyme sur le substrat à 37°c à pH=7.4 pendant 30 min, on dose l’excès de l’acétyl choline qui donne en milieu acide et sous l’action de l’hydroxylamine, l’acide hydroximique, celui-ci développe une coloration rouge en présence de FeCl3 → dosé à 520nm.

Interprétation des résultats

% Activité cholinestérasique Interprétation et mesure à prendre
100% – 75% Aucune meure à prendre
75% – 50% Refaire ultérieurement l’analyse dans un proche avenirExposition probable
50% – 25% Si le taux est confirmé, écarter le sujet exposé de tout travail en contact avec les pesticidesSurexposition grave : Refaire le test si confirmé, suspendre impérativement tout travail en contact avec les pesticides, un suivi médical et éventuellement un traitement sera instauré.
25% – 0% Surexposition sévère et dangereuse Refaire le test, si confirmé : Arrêt impérativement immédiat de tout contact avec les pesticides. Envoi immédiat du sujet dans un centre hospitalier.
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