Abonnez-vous par e-mail.

    Saisissez votre adresse e-mail pour vous abonner et recevoir une notification de chaque nouvel article par email.

    Rejoignez 37 autres abonnés

Cytotoxicité, Nécrose, Apoptose

La toxicité d’un agent chimique est caractérisée par une modification moléculaire initiale et une altération fonctionnelle des cellules  pouvant être qualifiée de rupture d’homéostasie.

Ce dysfonctionnement peut engendrer des lésions cellulaires et dans un cas extrême conduire a la mort de la cellule.

La lésion cellulaire : atteinte de la fonction et de la structure des cellules liée à une séquence d’événements apparaissant lorsque la cellule a dépassé ses possibilités d’adaptation à un stimulus. Les lésions cellulaires peuvent être réversibles : dégénérescence cellulaire, irréversible : mort cellulaire.

La mort cellulaire : peut se faire par deux processus différents  qui sont : la nécrose et l’apoptose.

Cytotoxicité

Cibles biologiques de l’action des toxiques

Les membranes cellulaires : elles peuvent être le siège d’altérations diverses :

  • la peroxydation lipidique
  • la perte de la perméabilité sélective de la membrane plasmique.

Les mitochondries : les toxiques  d’inhibent  :

  • la phosphorylation oxydative,
  • la béta-oxydation des acides gras,
  • la respiration cellulaire ayant pour conséquence une chute de concentration en ATP.

Les lysosomes : par  inhibition des capacités de dégradation de la cellule.

Le patrimoine génétique : peut être altéré par les  génotoxiques.

Mécanismes biochimiques impliques dans la mort cellulaire

  • l’élévation de la concentration cytosolique en Ca2+ (Ca2+i):
    • la concentration en Ca2+i est maintenue grâce à un contrôle très strict du transport membranaire et par le maintien des réserves internes situées dans les mitochondries et le réticulum endoplasmique, une rupture de cette régulation est souvent le premier événement du développement de la toxicité cellulaire,
  • la déplétion en ATP et/ou la diminution du rapport ATP/ADP. Ces événements sont consécutifs à des atteintes mitochondriales directes ou indirectes et entraînent :
    • des troubles de l’anabolisme;
    • un arrêt de la plupart des fonctions cellulaires essentielles;
    • une élévation du Ca2+i par inhibition des ATPases contrôlant l’homéostasie calcique.
  • l’altération de l’état d’oxydoréduction:
    • lié à l’effondrement du taux de glutathion réduit (GSH), ainsi que les activités enzymatiques superoxyde dismutase et catalase qui déterminent le statut antioxydant des cellules.

Méthodes d’études de la cytotoxicité

Il existe trois grands groupes de méthodes d’études de la cytotoxicité :

  • les méthodes fondées essentiellement sur des perturbations de la perméabilité membranaire,
  • les méthodes fondées sur des altérations de la prolifération cellulaire,
  • les autres méthodes.

Méthodes fondées essentiellement sur des perturbations de la perméabilité membranaire:

On distingue deux types :

  1. Méthodes de cytotoxicité utilisant des colorants :

Principe : utilisation d’un colorant qui, en fonction de ses caractéristiques, pénètre dans les cellules vivantes ou mortes.

La proportion relative des cellules colorées ou non est un reflet exact du nombre de cellules vivantes ou mortes et donc de la viabilité de l’ensemble de la population cellulaire, en relation directe avec la concentration du toxique étudié.

Il existe 3 types de colorants :

  • les colorants vitaux ou d’exclusion (cellules mortes)
  • les colorants supravitaux ou d’inclusion (cellules vivantes) (rouge neutre)
  • les colorants nécessitant une étape de métabolisation (sel de tétrazolium)

Méthodes mesurant le relargage des molécules dans le milieu extra cellulaire : comprenant une méthode enzymatique (mesure de la libération LDH et la méthode de radioactive qui consiste en la mesure de la libération du chrome radioactif (Cr5l lié de manière non covalente aux acides aminés basiques de protéines infra cellulaire libéré par les cellules mortes dans le milieu et quantifié par un compteur gamma).

Méthodes fondées sur les altérations de la prolifération:

Reposent sur le principe que tout effet toxique en tuant des cellules ou en bloquant le cycle cellulaire diminue la prolifération de la population.

On distingue 2 groupes de méthodes :

  • Méthodes de numération ;
  • Méthodes biochimiques (ADN, protéines totales reflet de nombres de cellules).

Autres méthodes :

De principes variés citons les méthodes morphologiques fondées sur l’étude des altérations cellulaires jusqu’à la lyse.

Nécrose

Définition : Mort cellulaire « désordonnée »  affecte en général des groupes de cellules.

Causes :

Agression exogène à la cellule:

  • Insuffisance d’apport en oxygène: hypoxie /ischémie.
  • Déséquilibre nutritionnel :privation de glucose
  • agents physiques (le traumatisme ,brulures, radiations, choc électrique).
  • agents chimiques /médicaments.
  • agents infectieux: BK: nécrose caséeuse.
  • R° immunologiques.

Mécanismes des lésions cellulaires et de la nécrose

Quatre  systèmes sont atteints  :

  • L’intégrité des membranes cellulaires
  • La respiration en aérobie
  • La synthèse protéique
  • L’intégrité de l’appareil génétique de la cellule

Lésions cellulaires réversibles

Mécanisme

–  ↓O2 Caire →    ↓ phosphorylation oxydative   →    déplétion en ATP responsable de:

–  Dysfonctionnement pompe à Na      →      ↑ Na, Ca intracellulaires   →  accumulation H2O →  lyse Cellulaire.

– ↑ glycolyse anaérobie      →     ↓ glycogène et pH intracellulaire.

– Déttachement des ribosomes du RE  →     ↓ synthèse protéique.

Morphologie

– Gonflement cellulaire et mitochondrial;
– Dilatation du RE et dispersion des ribosomes;

La chromatine nucléaire se fragmente en amas compacts de contours souvent irréguliers.

Lésions cellulaires irréversibles

Mécanisme

  • Dysfonctions mitochondriales irréversibles avec augmentation du calcium intra mitochondrial , responsable des  modifications de la perméabilité  mitochondriale;
  • Anomalies du cytosquelette par activation de protéases calcium-dépendantes;
  • Perte des phospholipides membranaires par activation de phospholipases calcium-dépendantes;
  • Excès de RLO → lésions des membranes cellulaires;
  • Lésion des membranes lysosomiales et digestion enzymatique des composants cellulaires.

Morphologie

– Gonflement des mitochondries;
– Lésions des membranes cellulaires;
– Rupture des lysosomes et autophagie;

Aspect morphologique de la nécrose

Morphologie de la nécrose cellulaire

  • Un gonflement de la cellule et des organites.
  • Une fragmentation de la chromatine nucléaire s’accompagnant d’une fragmentation aléatoire de l’ADN, nettement repérable en gel d’agarose.
  • Un éclatement cellulaire, et une réaction inflammatoire se développe habituellement dans le tissu adjacent  en réponse à la libération du contenu cellulaire (enzymes lysosomiales).

Morphologie de la nécrose tissulaire

  • Nécrose de coagulation Caractéristique de la mort cellulaire par hypoxie s’observe lors des infarctus et des brûlures.
    Préservation de la forme de la cellule et de l’aspect général du tissu, mais les cellules, nécrosées, sont éosinophiles, coagulées, avec disparition du noyau.
  • Nécrose de liquéfaction Habituelle dans les infections, se traduit par la formation de pus, mélange de débris cellulaires et de polynucléaires altérés.
  • Nécrose caséeuse caractéristique de la tuberculose.
  • La cyto-stéatonécrose:nécrose T adipeux, due à l ’activation des lipases pancréatiques.
  • nécrose hémorragique : Afflux sanguin/ zone nécrose ischémique.
  • nécrose gangréneuse : effet ischémie/anaérobies.
  • nécrose fibrinoïde : homogène, coloration

Mise en évidence de la nécrose

On utilise des techniques objectivant les altérations membranaires caractéristiques de la nécrose :

Libération d’hémoglobine par les globules rouges ;

Libération d’enzymes par des cellules diverses,

Libération de 51Cr ;

Entrée de colorant normalement imperméable aux cellules intactes.

APOPTOSE

Définition : Mort cellulaire , génétiquement programmée, nécessaire à la survie des organismes pluricellulaires.

Apoptose physiologique et pathologique

Physiologique

Organogense:

  • Genèse des doigts
  • Formation du cerveau

Système immunitaire:

  • Elimination des anticorps inactifs ou autoimmuns
  • Destruction des les lymphocytes T autoréactifs

Différenciation intestinale :

  • Phénomène apoptotique d’anoïkis

Dédifférenciation mammaire:

  • Elimination des cellules épithéliales des glandes mammaires après la période d’allaitement.

Pathologique :

Inhibition  de l’apoptose et augmentation de la survie cellulaire :

  • cancers (mutation du gène P-53)
  • maladies auto-immunes (défaut d’élimination des lymphocytes auto réactifs)

Apoptose excessive et une perte de cellules normales ou protectrices :

  • SIDA (déplétion lymphocytaire viro-induite du VIH)
  • Maladies neurodégénératives (amyotrophie spinale).

Causes (inducteurs)

  • Le stress : hypo-oxygénation, infection viral, accumulation des protéines dans le RE
  • Le traitement par des substances cytotoxiques ou des corticoïdes,
  • L’atteinte du DNA : irradiation (rayons UV ou X)
  • La privation de facteurs de croissance
  • La transmission d’un signal de mort (récepteur Fas des lymphocytes cytotoxiques, des natural killer, du facteur de nécrose TNFa ),
  • Perte des contacts cellulaires un phénomène  d’anoikis.

Les acteurs moléculaires de l’apoptose

Les gènes régulateurs d’apoptose

Acteurs moléculaires de l’apoptose
Acteurs moléculaires de l’apoptose

Les Caspases

Nomenclature : Protéases apoptogènes à cystéine: le C représente la Cystéine, aspase définit la spécificité de clivage des substrats après un acide aspartique.

Structure

  • un prodomaine N-terminal de taille variable,
  • un domaine qui deviendra après clivage la grande sous-unité (20kDa, qui porte le centre actif),
  • un domaine qui deviendra après clivage la petite sous-unité (10 kDa).

Activation

La conversion de la caspase à l’état de zymogène en une enzyme mature nécessite au moins deux clivages et  la caspase peut  s’assembler sous sa forme active, composée de deux grandes et de deux petites sous-unités (p10/p20)2.

Les caspases vont pouvoir s’auto-activer et/ou être activées par d’autre caspases.

Les caspases initiatrices activées, elles vont pouvoir cliver d’autres caspases encore à l’état de zymogène (notamment les caspases effectrices).

Activation des caspases
Activation des caspases

Les Bcl-2

Bcl-2 est le prototype d’une famille de gènes qui peuvent être soit :

  • pro-apoptotique : Bax, Bak, Bad, Bid…
  • ou anti-apoptotique : Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w À l’heure actuelle, il y a en tout 25 gènes connus de la famille Bcl-2.

Bcl-2 doit son nom à l’anglais B-cell lymphoma 2 (lymphome 2 à cellules B).

Mécanismes biochimiques

Le déroulement de l’apoptose s’effectue schématiquement en 2 phases :

  • La phase de déclenchement ou d’engagement survenant en réponse à un signal intrinsèque ou extrinsèque.
  • La phase d’exécution au cours de laquelle sont activées des enzymes qui dégradent les substrats cellulaires provoquant la mort apoptotique. Les enzymes majeures de cette étape sont appelées CASPASES.
Déroulement de l'apoptose
Déroulement de l’apoptose

La phase de déclenchement ou d’engagement :

Elle  est gouvernée par deux voies principales d’activation :

(1) Voie extrinsèque : La  voie  extrinsèque, impliquant des récepteurs appartenant à la superfamille des récepteurs au TNF( Tumor Necrosis Factor).

Recepteur-ligand → activation du recepteur→ recrutement proteines adaptatrices(lien)  →    clivage/activation caspases intiatrices →  clivage/activation caspases effectrices →  hydrolyse substrat specifique → apoptose.

Voie extrinsèque de l'apoptose
Voie extrinsèque de l’apoptose

(2) La voie intrinsèque mettant particulièrement en jeu la mitochondrie ; cette voie est gouvernée par des protéines appartenant à la superfamille de Bcl-2 elle est activé par : hypoxie, radiations ionisantes, RLO, toxiques,..etc.

libération Cyt C ds cytoplasme    →   association  CytC-APAf1-dATP    →  apoptosome et activation casp-9  →   activation casp3  → apoptose.

APAf1 : Apoptotic Protease Activating factor 1.

La phase d’exécution : Les caspases sont l’élément-clé de cette phase,présentes sous formes inactives, leur activation va être à l’origine de deux éléments essentiels permettant d’identifier l’apoptose: le clivage de l’ADN et le clivage protéique.

Clivage de l’ADN

  • clivage internucléosomique en fragments de 180 à 200 pb par des endonucléases dépendantes du Ca2+ et du Mg2+;
  • visible après migration sur gel d’agarose;
  • précède l’apparition des anomalies morphologiques.

Clivage protéique
A l’origine des anomalies morphologiques, il se traduit par:

  • Fragmentation du noyau et du cytosquelette entraînant la formation de corps apoptotiques phagocytés par les cellules
  • La cellule apoptotique, par exposition de phosphatidylsérine à la surface de la membrane cellulaire, explique sa reconnaissance précoce par le système phagocytaire et l’absence de processus inflammatoire.

Description morphologique de l’apoptose

les cellules en apoptose vont s’isoler des autres cellules.

La mitochondrie va subir plusieurs modifications majeures :

  • Relargage du cytochrome c dans le cytoplasme,
  • Diminution du potentiel membranaire et l’ouverture de pores spécialisés.
  • Le noyau se condense, puis la chromatine est clivée en fragments réguliers d’environ 180 pdb.
  • Bourgeonnement de la membrane plasmique et formation de corps apoptotiques;
  • La cellule va signaler son état apoptotique à son environnement notamment grâce au changement de localisation des molécules de phosphatidylsérines qui passent d’une orientation cytoplasmique vers une orientation extracellulaire.

Détection de l’apoptose

Detection des fragments de DNA par la methode TUNEL

Cette méthode permet de détecter  les coupures d’ADN en utilisant la desoxynucleotidyltransferase (Tdt). Un  système de révélation est associé à ces nucléotides permettant de localiser les fragments d’ADN.

La fragmentation de l’ADN  peut aussi être révélée par  électrophorèse.

Methode de revelation des chutes de potentiel transmembranaire au niveau des mitochondries

qui utilise le DiOC6 ce dernier pénètre peu dans la mitochondrie si le potentiel transmembranaire est bas.

Analyse moléculaire de FAS

. PCR;

. Clonage et séquençage.

Comparaison entre apoptose et nécrose

Comparaison entre apoptose et nécrose
Comparaison entre apoptose et nécrose

Conclusion

L’étude, du mécanisme d’action des toxiques présente un aspect essentiel de la toxicologie. En effet, elle permet de prévoir les manifestations pathologiques résultant d’une exposition de développer des antidotes, de formuler des tests biologiques, de détection, et d’étendre nos connaissances sur certains désordres métaboliques de divers processus biochimiques.

Share Button

Comments

So empty here ... leave a comment!

Laisser un commentaire

Sidebar