Spectres d’Absorption de l’oxyhémoglobine, carboxyhémoglobine, méthémoglobine

Principe

Nous avons déterminé les absorbances millimolaires des trois (03) dérivés cliniquement importants de l’hémoglobine d’adulte humaine dans le domaine spectral visible et le proche infrarouge (450-1000 nm) à savoir : l’oxyhémoglobine (HbO₂), la carboxyhémoglobine (HbCO) et la méthémoglobine (MetHb). Comme prévu, des courbes d’absorption spectrale de formes similaires ont été trouvées.

Matériel et méthode

Le sang humain d’adulte a été obtenu à partir de  donneurs apparemment en bonne santé, recueilli sur un tube sec contenant de l’héparine sodique (anticoagulant) (100 unités USP / ml sang). Le plasma a été extrait après centrifugation de l’échantillon à 3000 tours/mn pendant 5 minutes et les érythrocytes ont été mis en suspension dans un volume équivalent à celui du plasma extrait d’une solution de NaCl à 9 g/l. La concentration de l’hémoglobine a été maintenue à 100-150 g/l.

La solution de HbCO a été préparée à partir d’un culot globulaire d’un patient en bonne santé mélangé à une solution de NaCl à 9 g/l à des proportions volumiques égales respectivement à 45% et 55%. Le CO issu de la réaction de l’acide formique anhydre avec de l’acide sulfurique pur goutte à goutte dans une enceinte close a été mise en contact avec une dilution de 1/50^ème de la suspension érythrocytaire (fig. 1) en chauffant avec précaution selon la réaction :

H-COOH ↔ CO + H₂O

La préparation de l’oxyde de carbone doit  être conduite sous hotte bien ventilée, avec les précautions d’usage : tube de sûreté, emmagasinement du CO dans une cloche à gaz, etc …

L’espace de tête du tube a été branché à une source de vide pour maintenir une pression constante à l’intérieur du tube. A la fin de la réaction, la suspension érythrocytaire a été diluée à 1/5^ème par une solution de NaCl à 9 g/l. Une floculation différentielle de l’HbCO par rapport l’HbO₂ a été pratiquée à un pH situé entre 5.35 et 5.55 sous une température de 55°C pendant 5 minutes. La HbCO en solution a été récupérée par filtration et diluée à 1/40^ème par une solution de NaCl à 9 g/l.

La solution de désoxyhémoglobine a été préparée à partir d’une dilution érythrocytaire à 1/200^ème à partir du sang total d’un patient en bonne santé, en rajoutant 3 mg de Dithionite de sodium par 2 ml d’hydrolysat.

La solution de Méthémoglobine acide a été préparée on laquant  ml de sang dans environ 20 ml d’eau distillée, on rajoute   a été préparée à partir de la dilution précédente de 1 ml d’une solution à 4% de ferricyanure de potassium et on amène à 50 ml avec de l’eau distillée.

Pour préparer une solution de Méthémoglobine alcaline, une ou deux gouttes d’ammoniac concentré ont été ajouté à 10 ml de la solution de méthémoglobine acide préparé précédemment..

La mesure d’absorbance a été effectuée à température ambiante (20-24 °C) avec un modèle de spectrophotomètre à barrettes de diode BackMan ® Coulter ® dans le domaine spectral de 450-700 nm avec une longueur de trajectoire optique de 0.013 cm.

La cuve en quartz est directement remplie par la dilution de la suspension érythrocytaire à travers un filtre en coton hydrophile en ayant soins d’éviter tout contact avec l’air ambiant. ^[1]H-R. Olivier. Traité de Biologie Appliquée, les diagnostics microbiologiques … Continue reading

Spectres d’absorption (UV : 450-700 nm)

 

Note: L’application de cette technique a été appliquée dans le Laboratoire de Toxicologie avec le Matériel cité par des résidents en Toxicologie de la faculté d’Alger.