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Spectres d’Absorption de l’oxyhémoglobine, carboxyhémoglobine, méthémoglobine

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Nous avons déterminé les absorbances millimolaires des trois (03) dérivés cliniquement importants de l’hémoglobine d’adulte humaine dans le domaine spectral visible et le proche infrarouge (450-1000 nm) à savoir : l’oxyhémoglobine (HbO2), la carboxyhémoglobine (HbCO) et la méthémoglobine (MetHb). Comme prévu, des courbes d’absorption spectrale de formes similaires ont été trouvées.

Matériel et méthode

Le sang humain d’adulte a été obtenu à partir de  donneurs apparemment en bonne santé, recueilli sur un tube sec contenant de l’héparine sodique (anticoagulant) (100 unités USP / ml sang). Le plasma a été extrait après centrifugation de l’échantillon à 3000 tours/mn pendant 5 minutes et les érythrocytes ont été mis en suspension dans un volume équivalent à celui du plasma extrait d’une solution de NaCl à 9 g/l. La concentration de l’hémoglobine a été maintenue à 100-150 g/l.

La solution de HbCO a été préparée à partir d’un culot globulaire d’un patient en bonne santé mélangé à une solution de NaCl à 9 g/l à des proportions volumiques égales respectivement à 45% et 55%. Le CO issu de la réaction de l’acide formique anhydre avec de l’acide sulfurique pur goutte à goutte dans une enceinte close a été mise en contact avec une dilution de 1/50ème de la suspension érythrocytaire (fig. 1) en chauffant avec précaution selon la réaction :

H-COOH ↔ CO + H2O

La préparation de l’oxyde de carbone doit  être conduite sous hotte bien ventilée, avec les précautions d’usage : tube de sûreté, emmagasinement du CO dans une cloche à gaz, etc …

L’espace de tête du tube a été branché à une source de vide pour maintenir une pression constante à l’intérieur du tube. A la fin de la réaction, la suspension érythrocytaire a été diluée à 1/5ème par une solution de NaCl à 9 g/l. Une floculation différentielle de l’HbCO par rapport l’HbO2 a été pratiquée à un pH situé entre 5.35 et 5.55 sous une température de 55°C pendant 5 minutes. La HbCO en solution a été récupérée par filtration et diluée à 1/40ème par une solution de NaCl à 9 g/l.

La solution de désoxyhémoglobine a été préparée à partir d’une dilution érythrocytaire à 1/200ème à partir du sang total d’un patient en bonne santé, en rajoutant 3 mg de Dithionite de sodium par 2 ml d’hydrolysat.

La solution de Méthémoglobine acide a été préparée on laquant  ml de sang dans environ 20 ml d’eau distillée, on rajoute   a été préparée à partir de la dilution précédente de 1 ml d’une solution à 4% de ferricyanure de potassium et on amène à 50 ml avec de l’eau distillée.

Pour préparer une solution de Méthémoglobine alcaline, une ou deux gouttes d’ammoniac concentré ont été ajouté à 10 ml de la solution de méthémoglobine acide préparé précédemment..

La mesure d’absorbance a été effectuée à température ambiante (20-24 °C) avec un modèle de spectrophotomètre à barrettes de diode BackMan ® Coulter ® dans le domaine spectral de 450-700 nm avec une longueur de trajectoire optique de 0.013 cm.

La cuve en quartz est directement remplie par la dilution de la suspension érythrocytaire à travers un filtre en coton hydrophile en ayant soins d’éviter tout contact avec l’air ambiant. [1]H-R. Olivier. Traité de Biologie Appliquée, les diagnostics microbiologiques ...continue

Spectres d’absorption (UV : 450-700 nm)

 

Note: L’application de cette technique a été appliquée dans le Laboratoire de Toxicologie avec le Matériel cité par des résidents en Toxicologie de la faculté d’Alger. 

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Références   [ + ]

1. H-R. Olivier. Traité de Biologie Appliquée, les diagnostics microbiologiques (Tome III). 1964. Pages 166-168. 
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