Techniques immunologiques : Anticorps monoclonaux vs Anticorps polyclonaux

Les antisérums polyclonaux contiennent un mélange complexe d’anticorps produits pendant le processus d’immunisation. Par comparaison, un anticorps monoclonal est une entité unique qui résulte de l’isolement d’une seule cellule productrice d’anticorps. Dans les immunodosages des molécules médicamenteuses, les anticorps à plus haute affinité produits par les antisérums polyclonaux peuvent parfois être préférables aux anticorps de plus faible affinité produits par un système monoclonal.

Les sérums immuns polyclonaux

L’immunisation d’un lapin ou d’un mouton se déroule habituellement avec 20 à 100 pg de l’haptène conjugué à une protéine, qui peut être combinée à un adjuvant pour stimuler le système immunitaire. Cela produit une réponse immunitaire composée principalement d’IgM suivie d’IgG. Cette réponse est encore stimulée par des immunisations supplémentaires d’une dose similaire ou plus faible à des intervalles réguliers – typiquement toutes les 3 à 4 semaines pendant 20 semaines ou plus. Des prélèvements de sang d’environ 1 à 2 mL sont prélevés 10 à 14 jours après l’injection, à ce moment la réponse immunitaire (et donc le taux d’anticorps dans le sérum) est le plus élevée.

Après analyse, un échantillon d’antisérum peut être prélevé. Cela peut aller jusqu’à plusieurs centaines de millilitres lorsqu’on utilise des animaux hôtes plus gros (par exemple des moutons). Le rendement d’extraction des antisérums peut varier de centaines à plusieurs milliers de tests par millilitre en fonction du succès du programme d’immunisation et du type de dosage dans lequel ils sont employés. Ce n’est pas le volume absolu de sérum qui est important, mais plutôt la quantité et la qualité des anticorps qui y sont contenus.

En utilisant des méthodes de séparation standard, telles que la précipitation au sulfate d’ammonium, la séparation de la protéine A et / ou la Chromatographie par échange d’ions, les antisérums peuvent être purifiés pour une utilisation ultérieure. La Chromatographie d’affinité peut être bénéfique dans certaines circonstances et implique le passage de l’antisérum sur une colonne qui contient une forme immobilisée du médicament d’intérêt. De cette manière, il est possible de fractionner un antisérum polyclonal complexe. Dans certains cas, la purification n’est pas nécessaire et l’antisérum (c’est-à-dire le sérum lui-même) peut être utilisé avec une simple dilution.

Les anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux offrent l’avantage d’une source continue d’anticorps avec les mêmes caractéristiques, de sorte qu’une fois qu’un bon anticorps est sélectionné, il puisse être utilisé indéfiniment.

Après l’immunisation et les saignements de test réussis, les anticorps monoclonaux sont fabriqués par la fusion de lymphocytes de la rate de souris (ou de lymphocytes provenant d’autres espèces) avec des cellules de myélome. Les cellules d’hybridome résultantes sont séparées par dilution limitante pour donner des cellules uniques qui sécrètent des anticorps monoclonaux uniques. Cette technique a été décrite pour la première fois en 1975 et est maintenant couramment utilisée (Kohler et Milstein, 1975).

Les anticorps monoclonaux ont généralement moins d’affinité que les équivalents polyclonaux, ce qui peut conduire à des dosages moins sensibles. Les anticorps monoclonaux ne sont pas plus spécifiques que les antisérums polyclonaux, mais une fois qu’un anticorps spécifique est sélectionné, la lignée cellulaire peut être stockée et l’anticorps produit indéfiniment. Il est à noter que dans les tests de dépistage des drogues, il est possible qu’un anticorps soit trop spécifique car il peut être souhaitable d’avoir une large réactivité croisée avec une famille de médicaments (comme les benzodiazépines) ou avec un seul médicament et ses métabolites (comme la buprénorphine) .

Les anticorps monoclonaux offrent les avantages de la pureté et de l’homologie, ce qui est utile dans les circonstances dans lesquelles l’anticorps est marqué ou conjugué dans le cadre de l’immunodosage mis en place – par exemple lorsqu’il est marqué avec une enzyme ou revêtu de particules d’or colloïdal.

D’autres techniques de biologie moléculaire et de recombinaison, telles que l’exposition au phage (Chiswell et McCafferty, 1992), dans lesquelles le code génétique est utilisé pour produire des anticorps, fournissent une source supplémentaire intéressante de ce composant immunologique important.

Courbes de dilution d’anticorps

Une fois qu’une immunisation est en cours, la qualité de l’antisérum est évaluée au moyen d’une courbe de dilution d’antisérum. Les courbes de dilution d’anticorps démontre la liaison de l’anticorps au médicament cible et est une indication de l’affinité de l’anticorps pour l’antigène. En utilisant un essai immuno-enzymatique hétérogène (EIA) à titre d’exemple, on a revêtu une microplaque à différentes dilutions dans un tampon bicarbonate (pH 9), en incubant une nuit à température ambiante. La liaison résultante à différents titres de cotinine marquée à la peroxydase de raifort. Des dilutions du conjugué enzyme-médicament pour ce type d’expérience peuvent être réalisées dans un tampon phosphate simple (pH 7,4) avec une petite quantité de protéine (par exemple BSA à 0,05% p / v) pour empêcher la liaison non spécifique des matériaux au tube de dosage. Le crochet (ou pic apparent) à des concentrations élevées d’antisérum est provoqué par une combinaison d’empêchement stérique et de saturation de l’anticorps de revêtement à la microplaque.

Une fois que la concentration d’anticorps (titre) qui produit la réponse souhaitée est sélectionnée, il est nécessaire de vérifier que l’anticorps réponde également au besoin avec le médicament cible (c’est-à-dire que le médicament cible entre en compétition avec le médicament marqué pour se lier à l’anticorps) . La performance améliorée avec des bleed tests subséquentes pour des échantillons prélevés chez un lapin immunisé avec un immunogène de la protéine- buprénorphine. Il est possible d’obtenir des informations utiles en combinant les deux expériences décrites ci-dessus et en analysant à la fois un échantillon positif et négatif à chaque dilution d’anticorps. De cette façon, la liaison et le déplacement peuvent être observés à chaque titre d’anticorps.

Un titrage soigneux du dérivé de médicament marqué et de la dilution d’anticorps peut améliorer les caractéristiques du dosage et le dosage peut être optimisé davantage par l’addition d’autres protéines, tensioactifs et stabilisants au tampon de dosage.

Un programme d’immunisation implique habituellement l’injection de trois à six animaux avec le même antigène. Si des anticorps appropriés ne sont pas produits après plusieurs immunisations, il peut être nécessaire de recommencer le programme avec différents animaux et éventuellement un immunogène différent.

Traduit en Français par : BENSAKHRIA Ayoub (source: Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons 3rd Edition)