CCM Multi-système

La chromatographie sur couche mince ou chromatographie planaire (CCM, en anglais TLC pour Thin layer chromatography) est une technique de chromatographie couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d’analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM préparative).

Elle comprend :

Une phase stationnaire : une couche mince de matériel adsorbant (usuellement du gel de silice, de l’oxyde d’aluminium ou de la cellulose) de 100-200 mm généralement déposée sur une plaque rectangulaire en verre, en aluminium, de quelques cm de côté. On distingue 3 étapes :

• Préparation des plaques
• Dépôt de l’échantillon
• Développement des plaques

Le développement des plaques se fait sur des milieux spécifiques dits phases liquides.

Une phase liquide, dite phase mobile ou éluant est un solvant ou un mélange de solvants qui va entraîner les composés à séparer le long de la phase stationnaire.

Généralement, le phénomène d’adsorption est prépondérant (mais il y a également partage si le solvant est un mélange).

La chromatographie sur couche mince multi-système se fait sur 4 systèmes de phases mobiles dans des milieux clos suffisamment saturés dans cuves d’élution, à savoir TA, TD, TE, TB

Protocole opératoire

Réactifs

1.    Ether 2.    Chloroforme 3.    Acétone 4.    Méthanol 5.    Ammoniaque 6.    Ethyle Acétate 7.    NaOH 10N 8.    HCl 6N

Matériel

1. Plaques de CCM en gel de silice (10 x 10 cm)
2. Cuves de développement des plaques (4) (en verre borosilicaté dimensions : hauteur : 14 cm, largeur 13 cm, épaisseur : 9 cm.)

1. Ampoules à décanter (4)
2. Cristallisoirs (4)

Préparation des phases mobiles

• Dessiccation des plaques : 30 mn à 100°C dans l’étuve.
• Préparation des phases mobiles :
• La phase TA: Méthanol + Ammoniaque (50 : 0.750) ml volume : volume
• La Phase TD: Chloroforme + Acétone (40 : 10) ml volume : volume
• La phase TE: Ethyle Acétate, Méthanol, Ammoniaque (42.3 : 5 : 2.5) ml volume :volume :volume.
• La phase TB: Cyclohexane, Toluène, Diéthylamine (37.5 : 7.5 : 5) ml volume : volume : volume
• Laisser saturer les cuves pendant au moins 30mn.

Extraction

Procéder à une extraction acide à l’éther  et basique au dichlorométhane (se référer au chapitre « identification des toxiques »).

Séchage :

L’extractum (phase organique) récupéré après déshydratation (au sulfate de sodium anhydre) et filtration à l’aide d’un papier filtre, dans des cristallisoirs en verre et desséché sur la plaque chauffante.

Dépôt de l’échantillon

On commence par déposer un petit volume (compris entre quelques nanolitres et plusieurs microlitres) de l’échantillon en solution diluée, à proximité du bord inférieur de la plaque sous forme d’une tache de 1 à 3 mm de diamètre. Ce dépôt est réalisé soit manuellement,  soit de manière automatique, avec un capillaire à extrémité plane (fig. 5.1). La tache peut également avoir la forme d’un trait horizontal de quelques mm, obtenu par pulvérisation de l’échantillon au moyen d’un dispositif automatique dont l’intérêt est de pouvoir maîtriser la reproductibilité des quantités déposées, ce qui est indispensable en analyse quantitative.

La plaque ainsi préparée est introduite dans une cuve spéciale munie d’un couvercle, au fond de laquelle se trouve un peu de la phase mobile servant d’éluant. L’endroit où l’échantillon se trouve doit être situé au-dessus du niveau d’immersion.

• On utilise des plaques de 10×10 cm pour 8 points de dépôts.
• On dépose pour chaque plaque, la molécule de référence (voir tableau dans la section ‘annexes’) du système de migration et une molécule étalon.
• Pour le système TA on dépose 4 points de l’extractum alcalin et un point de l’extractum acide.
• Inversement pour le TD on dépose 4 points de l’extractum acide et un point de l’extractum alcalin.
• On dépose en parallèle pour le système TE ss2 points de l’extractum acide et 2 points de l’extractum basique.
• Même étape précédente pour le système TB si les trois milieux précédents n’ont pas permis de séparer les substances en question.

Développement des plaques

La phase mobile migre par capillarité à travers la phase stationnaire sèche, entraînant à des vitesses différentes les constituants à séparer. Le temps de migration (plusieurs minutes) dépend de divers paramètres. Quand le front de solvant a parcouru une distance considérée comme suffisante (quelques centimètres), on retire la plaque de la cuve, on repère la position limite atteinte par la phase mobile et on évapore cette dernière.

Lorsqu’on utilise une plaque à polarité de phase inversée (« RP−TLC »), l’éluant comporte de l’eau. Il est alors utile d’ajouter un sel, tel du chlorure de lithium, pour limiter les phénomènes de diffusion et augmenter ainsi la résolution.

Tableau de référence des Rf (rapports frontaux)

Nous avons procédé à un traitement de 21 étalons (y compris les molécules de référence Amitriptyline (TA) Paracétamol (TD) Prazépam (TE) et Trimipramine (TB)). La même procédure a été répétée 3 fois par trois manipulateurs différents mais toujours dans les mêmes conditions opératoires.

Le tableau ci-dessous montre les valeurs moyennes des Rf obtenus après les 3 manipulations.

A noter que pour une même molécule, les valeurs des Rfs retenues sont seules qui présentaient un écart type faible au cours des 3 manipulations.

Tableau 1: Rapport frontaux des substances médicamenteuses.

	Rapport frontaux (RF) x 100
Molécule	TA	TD		TE	TB
Glimépiride	86	55		12	0
Prednisone	86	21		62	0
Betametazone	85	40		78	0
Atorrvastatine	85	8		2	0
Valsartan	85	10		1	0
Gliclazide	85			10	0
Hydrocortisone	82	12		61	0
Paracétamol	79	24		66	0
Nifluril	81	35-55 (fusée)		16	0
Ketoprofen	81	59		2	0
Tétrazépam	80	68		89	47
Chlorazépate	80	40		80	8,7
Prazépam	81	69		88	5
Naproxène	80	67		5	0
Diclofénac	80	65		11	0
Acetazolamide	80	6		11	0
Flunastatine	80	0		0	0
Amiloride	80	6		55	0
Lansoprazole	80	8		49	0
DHE	80	0		55	0
Spironolactone	80	75		91	16
Piroxicam	80	67		16	0
Furosémide	79	16 (fusée)		6	0
Dompéridone	79			56	0
Zolpidem	79	21 (fusée)		72	8,75
Pyrazinamide	79	12		59	6
Diazépam	78	65		86	38
Bromazépam	78	9		77	4
Rifampicine	7			12
Metronidazole	78	56		84	11
Hydrochlorothiazide	78	6		46	0
ketoprofène	78	56		4	0
Indométacine	78	42		10	0
Halopéridol	76	0		86	21
Ketoconazole	76	4		65	0
Lamotrigine	76	0		62	0
Fluconazole	75	5		45	0
Carvedilol	74	0		72	4
Amiodarone	73	7,5		79	96
Carbamazépine	72	35		69	6,2
Atarax	72	0		63	16
Amiloride	72	2		55	0
Atropine	71	27		69	0
Dextropropoxyphène	70	4		89	0
Miansérine	68	10		82	59
Trimipramine	66	0		90	84
Lévomépromazine	62	0		90	74
INH	62	9		30	0
Flecainide	62	1,25		68	5
Sertraline	59	0		85	70
Amitriptyline	56	0		80	75
Propranolol	57	0		62	12
Métoprolol	55	0		60	14
Chlorpromazine	53	0		86	72
Clomipramine	53	0		86	80
Ranitidine	52	0		34	0
Salbutamol	51	56		20	0
Ketotifen	49	1		71	31
Imipramine	48	0		82	76
Aténolol	46	0		12	0
Oméprazole	45	10		68	0
Polaramine	45	61		0	0
Acébutolol	41	0		29	0
Sulpiride	40	0		38	0
Codéine	38	38		10	0
Fluoxétine	34	0		49	22
Cyanocobalamine	34	0		0	0
Cocaine	30	0		0	0
Amlodipine	30		0	31	2,5
Paroxétine	25	0		49	10
Pseudoephedrine	21	0		12	9
Betahistidine	12	0		6	8
Captopril	6	0		0	0
Metformine	4	0		1	0
Ibuprofène	0	74		7	0

Note : Les valeurs des rapports frontaux dans le tableau sont multipliées par 100.