Les benzodiazépines (BZD) sont une classe de molécules chimiques hétérocyliques formées d’un cycle diazépine attaché à un benzène. Ces molécules forment ensemble une classe thérapeutique de médicaments psychotropes utilisés dans le traitement des convulsions, de l’agitation psychomotrice de l’anxiété, de l’insomnie, des spasmes, ou dans le contexte d’un syndrome de sevrage alcoolique.
Les benzodiazépines agissent principalement sur les neurotransmetteurs neuronaux du Système nerveux central en augmentant leur activité inhibitrice. Par ce mécanisme, les benzodiazépines sont utilisées afin de provoquer un état de sédation et/ou pour leurs propriétés hypnotiques, anxiolytiques, antiépileptiques, amnésiantes et myorelaxantes. [1]http://fr.wikipedia.org/wiki/Benzodiaz%C3%A9pine [archive] consulté le … Continue reading
L’usage à long terme peut être la cause d’une accoutumance (tolérance), d’une addiction (dépendance) et d’un syndrome de sevrage à l’arrêt brutal de consommation.
La première molécule en forme médicamenteuse de la classe des benzodiazépines est apparue dans les années 1960, de nombreuses spécialités voient le jour un peu plus tard dans les années 1970. Leur usage concurrence celui des barbituriques.
Recherche et dosage
Recherche
Recherche par colorimétrie
Principe
Coloration spécifique après hydrolyse acide et réaction avec un réactif spécifique à partir des urines.
Réactifs
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Matériel
- Tubes à essais
- Porte tubes à essais
- Pipettes
- Eprouvettes de 10ml
Technique
Mettre dans trois tubes à essai 1ml d’urine et 1 ml d’acide chlorhydrique 6N. Introduire les deux derniers au bain marie bouillant pendant 10 minutes, refroidir ces derniers sous un courant d’eau froid puis ajouter dans chaque tube 0,5 ml de sulfamates d’ammonium et 0,5 ml du réactif de Tréfouël.
La présence des benzodiazépines se traduit par l’apparition d’un spot violet.
Recherche par spectrophotométrie
Principe
Les benzodiazépines sont extraites à partir du sang en milieu acide à PH=6,7 par l’éther. Le dosage consiste à rechercher le maximum d’absorption.
Réactifs
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Matériel
- Tubes à essais
- Porte Tubes à essais………………………………….1
- Ampoule à pied……… ………………………..….……1
- Verre à décantation…………………………….……..1
- Micropipettes de 1 ml …………………………..…..1
- Pipettes
Technique
Mélanger :
- 6,5 ml d’éther.
- 1 ml de la solution tampon à pH =6,7.
- 0,5 ml d’eau distillée.
- 1 ml du sang
Agiter au vortex pendant 3 secondes, centrifuger.
Mettre le mélange dans une ampoule à décantation, récupérer la phrase éthérée puis rincer cette phase avec:
- 1er avec 3 ml de Na OH 0,1N
- 2ème avec 2 ml d’eau distillée.
Faire un spectre d’absorption dans L’U.V entre (200-400) nm contre HCI 2N.
Résultats:
- a) Chercher le maximum d’absorption.
- b) Calculer le coefficient d’extinction molaire.
Recherche par Chromatographie sur couche mince (CCM)
Principe
Les dérivés benzodiazépiniques et leurs métabolites présents dans les urines conduisent, par l’action hydrolysante de d’acide chlorhydrique et à 100°C, à la formation de dérivés qui, séparés par chromatographie sur couche mince, permettent l’identification partielle des benzodiazépines mais, surtout, le classement du composé absorbé en fonction de son activité thérapeutique.
Réactifs
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Matériel
- Erlenmeyers de 250 ml B.E………………………..2
- Béchers de 250 ml ……………………………………2
- Béchers de 100ml…………………………….……….2
- Ampoules à décantation ……………………..…….2
- Pipettes (types pasteur).
- Plaques recouvertes de Silicagel.
- Lampe ultraviolette.
- Entonnoirs………………………….…………………2
Mode opératoire
– Préparation des dérivés d’hydrolyses :
Dans un erlenmeyer de 250 ml bouchant émeri, placer 5 ml d’urines et 2 ml d’acide chlorhydrique (d= 1,18).
Porter le mélange pendant 5 minutes au bain marie à 100°C. Après refroidissement, extraire les produits d’hydrolyse par 10ml d’éther éthylique.
Après séparation, la phase éthérée est lavée deux fois avec 5ml de solution aqueuse d’acide chlorhydrique N, puis deux fois avec 5 ml d’eau distillée.
Après déshydratation par agitation avec du sulfate de sodium anhydre, l’extrait éthéré est évaporé.
La solution dans L’éthanol à 95° du résidu d’évaporation est soumise à l’analyse chromatographique.
Analyse chromatographique
- Absorbant : Couche mince d’oxyde d’aluminium F 254 ; type F, Merk n° 5713/0025 « plaque prêtes à l’emploi conservées en dessiccateur».
- Substance de référence : Benzophénone : 3/1.
- Solvant de migration : – Benzène-chloroforme : 3/1.
– Migration : 10 à 12 cm
Révélation
- Sous lampe ultraviolette à 254 nm
- Réaction de diazocopulation :
Pulvériser sans excès une solution de nitrite de sodium à 0,5% dans l’acide chlorhydrique (d=1,18) au 1/10 (préparée extemporanément).Attendre 5 minutes.
Sécher la plaque sous un courant d’aire tiède. Pulvériser enfin le réactif de Tréfouel « solution aqueuse à 0,1% de chlorhydrate de N-alpha naphtyl N, N-diéthylpropylène diamine ».Les sports correspondant aux amines aromatiques primaires apparaissent en quelques minutes colorés en violet.
La coloration s’intensifie plus rapidement en plaçant les plaques de chromatographie à +50°C.
Dosage
Dosage par spectrophotométrie
Principe
Hydrolyse acide à chaud des dérivés de la benzo (f) –diazépine- 1,4 et de leurs métabolites dans les liquides biologique, les produits obtenus peuvent être caractérisés par spectrophotométrie après diazocopulation.
Réactifs
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Matériel
- Spectrophotomètre
- Bain-marie thermostaté (60°C)
- Bain-marie bouillant
Mode opératoire
Dans deux Erlenmeyers :
Dosage | Etalon | |
Urines ou Plasma | 5ml | – |
Solution étalon à 100 µg/ml | – | 5ml |
HCl 6N | 1ml | 1ml |
- Faire bouillir 45 mn.
- Après refroidissement, alcaliser à pH = 10 et extraire par 20 ml d’éther. Laver l’extrait éthéré par 5 ml de la solution saturée de sulfate de sodium. Sécher la phase organique par un peu de sulfate de sodium sec.
- Evaporer l’éther
- Reprendre par l’HCl 6N :
- 5 ml (plasma)
- 5 ml (urines)
- 5 ml (étalon)
Coloration
50 µg | 100 µg | 150 µg | Plasma | Urines | Blanc | |
Etalon | 0.5 | 1 | 1.5 | |||
Plasma | 1.5 | |||||
Urines | 1 | |||||
HCl 6N | 1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Eaud | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
NaNO2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
Agiter, attendre 3 mn | ||||||
SulfNH4 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
Agiter vigoureusement. Attendre 10 mn en agitant de temps en temps | ||||||
NED | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Agiter, porter à 60°C pendant 5 minutes | ||||||
Lire les D.O à 550 nmEtablir la courbe d’étalonnage, et lire le taux de benzodiazépines. |
Dosage par chromatographie liquide haute performance (HPLC)
La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) —on trouve plus fréquemment l’abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) en fonction de l’hydrophobicité et préparative des molécules d’un composé ou d’un mélange de composés. Pour certains, HP signifie « haute pression ».
Références
↑1 | http://fr.wikipedia.org/wiki/Benzodiaz%C3%A9pine [archive] consulté le 10/01/2015 |
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Last modified: 10 janvier, 2015
Bonjour
S’il vous plaît comment peut on calculer le coefficient d’extinction molaire ? On n’a pas la concentration de la solution traversée.. :!
Merci de bien m’aider
À toute
[…] 2.3.3. La Diazocopulation (cf. recherche et dosage des benzodiazépines) […]
[…] existe des méthodes rapides de recherche semi-quantitative des benzodiazépines qui peuvent être réalisées sur le plasma ou les […]