Méthodes séparatives

Les techniques de séparation utilisées en toxicologie pour détecter, identifier et doser une molécule toxique, regroupent principalement les méthodes chromatographiques et plus récemment les méthodes électrophorétiques avec l’électrophorèse capillaire et ses variantes.

De nos jours, les méthodes chromatographiques couplées à divers détecteurs occupent la plus importante place dans le screening toxicologique car elles permettent de caractériser simultanément un éventail très large de molécules avec une meilleure spécificité et une plus grande sensibilité comparées aux méthodes précédentes. Elles sont applicables à tous les milieux biologiques, quelle qu’en soit la nature, après une étape d’extraction rendue nécessaire du fait de la complexité de ces matrices.

Les fournisseurs de matériel chromatographique, pour satisfaire les besoins de certains laboratoires, ont développé de nouvelles méthodes plus rapides. De nouveaux supports et des nouvelles phases stationnaires sont apparus sur le marché, le « hardware » et ses possibilités ont également beaucoup évolués pour s’adapter à ces changements (Kintz,2012).

Les propriétés physico-chimique des analytes conditionnent la détection par chromatographie, ce qui explique qu’il n’y ai aucune méthode chromatographique qui permette la détection de toutes les substances et qu’une bonne stratégie de STA impose la disposition de plusieurs méthodes chromatographiques complémentaires (Drummer,1999)

La chromatographie sur couche mince (CCM)

 La CCM développée dans les années 50 eu un impact significatif dans la séparation et l’identification des substances en toxicologie. Depuis son application et jusqu’au début des années soixante-dix, elle occupa la place la plus importante dans le screening car elle permet l’identification de centaines de molécules et leurs métabolites dans les fluides biologiques.

Son principe repose sur séparation des substances grâce au déplacement par capillarité d’une phase mobile à travers une phase stationnaire sur laquelle est déposé l’échantillon a analysé.

Avantages de la CCM

La CCM est une méthode très simple, sa manipulation ne nécessite pas une formation spéciale et le matériel requis pour sa réalisation est simple, disponible et peu couteux.

C’est une méthode séparative non destructive et les molécules séparées peuvent être identifiées grâce à leurs distances de migration (Facteur de rétention Rf ) et se prêtent plus aisément aux tests spécifiques d’identification tels que les réactions colorées , réalisées directement sur plaque par pulvérisation de révélateurs , ou par balayage spectral du produit récupéré en raclant la phase stationnaire dans une solution adéquate, ce qui élargie encore plus l’analyse et rend l’identification plus sure .

La collection des fractions après séparation permet aussi de réaliser une deuxième analyse de confirmation par une technique plus spécifique telle que l’analyse immunochimique ou la chromatographie liquide. Elle est très avantageuse car impossible par GC et très complexe par LC (Kintz,1998)

Dans le cadre du STA, à la recherche de molécules inconnue, l’utilisation d’un seul système de migration n’est pas suffisante car plusieurs molécules peuvent avoir des Rf identiques ou proches dans ce système. Néanmoins, chaque molécule ayant un comportement différent selon la composition de la phase de migration, le recours à plusieurs systèmes permet d’avoir pour chaque molécule son propre profil de migration (Rf en fonction du système) et augmenter ainsi les chances d’identification pour les molécules qui n’ont pas de tests spécifiques de caractérisation.

L’utilisation simultanée de plusieurs systèmes de migration joue aussi un rôle très important dans le cas des intoxications poly-médicamenteuses offrant une meilleure séparation des molécules et/ou métabolites dont la superposition complique la réalisation des tests d’identification.

Dans cette optique, plusieurs publications portent sur les différents systèmes de migration pouvant être utilisés pour le screening toxicologique. En 1991, P.Lillsunde publie une méthode de CCM utilisant 9 systèmes de migration pour la détection de plus de 300 molécules et confirme ses résultats par GC-MS (Drummer,1999).

Au niveau du laboratoire de toxicologie de l’HCA, nous avons optimisé la séparation et l’identification par CCM multi-système de 64 molécules recouvrant la majorité des classes thérapeutiques les plus fréquemment incriminées dans les intoxication, et cela en déterminant leur Rf respectifs dans 4 systèmes de migration différents ( TA,TB,TE et TD , Clark’s 2011) avec intégration d’une molécule de référence pour chaque système comme témoin de reproductibilité et en déterminant leur profil colorimétrique grâce à 5 réactifs révélateurs : Le réactif de Mandelin , Iodoplatinate acidifié , réactif de Marquis , réactif de Forest et le réactif phosphocerique (Mélaine,2012).

Limites de la CCM

Les inconvénients majeurs de la CCM classique, sont le manque de sensibilité et de résolution et l’influence des conditions environnementales surtout la température ambiante et le taux d’humidité sur la répétabilité des résultats (Ojanperii,1992).

De plus la nature de la phase stationnaire ne permet pas toujours l’immersion des plaques dans les réactifs de caractérisation imposant la pulvérisation de ces réactifs toxiques.

Enfin, la durée de réalisation reste relativement longue comparée aux techniques chromatographiques en phase liquide et gazeuse et les résultats sont souvent difficiles à interpréter surtout en cas d’intoxication poly-médicamenteuse ou en présence de beaucoup de métabolites.

Malgré les inconvénients que présente la CCM, sa réalisation selon une procédure standardisée en plus de l’utilisation simultanée de plusieurs  systèmes de migration avec les bons réactifs révélateurs,  lui confère un degrés de certitude proche des techniques conventionnelles de confirmation (Drummer,1999). La CCM classique reste, même de nos jours, la principale méthode de screening toxicologique dans de nombreux laboratoires qui ne peuvent supporter le cout élevé des équipements de CG et LC (Langman,2006) . Ces laboratoires doivent connaitre ses limites et exploiter au mieux ses atouts.

Nouvelles techniques de CCM

En parallèle à l’évolution des techniques de chromatographie sur couche mince et aux améliorations apportées ces dernières années, l’utilisation de la CCM dans le screening toxicologique à beaucoup évoluée surtout depuis l’apparition de méthodes hautes performance (HPTLC), qui exploitent  les vertus de la CCM pour la séparation et de la spectrophotométrie UV/Visible pour la détection (Ahrens,2002).

Aussi, une certaine automatisation est proposée par les fabricants afin de pallier aux soucis de reproductibilité. Les automates  permettent le dépôt automatique de l’échantillon, une migration dans des cuves à saturation contrôlée et même des méthodes à gradient sont disponibles. L’automatisation s’étend même à la phase de révélation, avec des systèmes de lecture par scanner  UV qui réalisent l’identification par rapport à une librairie permettant une approche semi-quantitative et aussi la possibilité de couplage de la CCM à la spectrométrie de masse (Kintz,1998).

Chromatographie en phase gazeuse (GC)

La chromatographie gazeuse est une méthode séparative où les molécules d’intérêt sont retenues par une phase stationnaire liquide ou solide contenue dans une colonne  dont la température est régulée. Ces molécules seront éluées par la suite grâce à un gaz vecteur qui les entraine vers un détecteur de grande sensibilité.

Cette technique séparative occupe une place très importante dans l’analyse toxicologique. Elle est largement utilisée tant pour la détection que pour la quantification d’un très large nombre de composés surtout depuis l’avènement des colonnes capillaires dotées d’un grand pouvoir séparateur et d’une forte stabilité. Aussi, les données de rétention de la GC sont reproductibles dans le temps et entre manipulateurs et laboratoires.

La GC-FID est considérée comme la technique de référence pour la détection et l’identification des alcools, glycols et autres solvants. Elle est aussi utilisée pour le screening de certaines classes thérapeutiques (Lo,1997 ; Maurer,1999).

La GC-MS reste la méthode de référence ou « Golden standard » pour le STA. En effet, en plus des nombreux avantages pratiques de la GC, le couplage à un détecteur de masse de très grande sensibilité et spécificité , le pouvoir séparateur important de la colonne capillaire et la standardisation des procédures d’ionisation qui a permis la réalisation de librairies de spectres de masse de référence très larges et universelles (plus 8000 substances d’intérêt clinique dont plus 5000 métabolites), font de cette méthode un outil puissant tant pour l’identification que pour la quantification des xenobiotiques dans les milieux biologiques.

Néanmoins, cette technique n’est pas dénuée d’inconvénients. Le plus important est l’absence de  compatibilité entre le système chromatographique et la matrice biologique aqueuse. Un traitement d’échantillon long et laborieux est obligatoire avant l’analyse et comprend le plus souvent un clivage des conjugués dont le poids moléculaire (PM) et la polarité trop élevée ne permettent pas l’analyse directe,  une extraction  et une derivatisation .

De plus, seuls les analytes peu ou pas polaires qui sont volatils et résistant à la chaleur, peuvent être détectés directement. Les molécules polaires et de haut PM y compris les métabolites ne peuvent être analysés sans traitement préalable, ce qui est problématique vu que la plus part des nouveaux médicaments sont plus polaires et donc moins volatils (Ojanpera,2012).

Enfin, certains produits thermolabiles peuvent se retrouver dans l’extractum et leurs produits de décomposition peuvent gêner l’analyse. De ce fait en plus du choix rigoureux de la procédure du traitement d’échantillon, du type de colonne et des conditions de chromatographie et de détection, certaines précautions doivent être prises lors de la collecte et conservation des échantillons et même  du choix de l’étalon interne  (Flanagan,2007).

Devant les avantages qu’offre la GCMS dans le STA, les procédures analytiques ont été développées et améliorées ces dernières années dans le but de palier aux inconvénients de cette technique. Les améliorations portèrent surtout sur la réduction du temps nécessaire au traitement d’échantillon afin de mieux l’adapter à l’urgence.

Le clivage des conjugués se fait par hydrolyse acide rapide, l’extraction par SPE est choisie pour l’extraction de molécules dotées de propriétés chimiques très différentes et enfin l’acétylation permet une derivatisation robuste qui améliore les limites de détection de millier de drogues et leur métabolites. De plus l’usage de micro-ondes réduit le temps d’incubation pour la derivatisation de 30  à 5 minutes (Maurer,2010).

De très nombreuses procédures de screening par GCMS ont été décrites ces dernières années. Grâce à l’utilisation de librairie de référence ces procédures de screening en mode full-scan permettent en une seule analyse la détection d’un très grand nombre de xenobiotiques ainsi que leurs métabolites. La procédure la plus performante permet la détection de plus de 2000 molécules (Maurer,2010).

Chromatographie liquide (LC)

Chromatographie liquide haute performance couplée à un détecteur UV à barrettes de diodes (HPLC-DAD)

L’ HPLC-DAD fut la première technique chromatographique en phase liquide à être utilisée dans le screening toxicologique large.  Elle permet l’analyse simultanée d’un grand nombre de molécules dotées de propriétés physico-chimiques très variables, surtout en terme de polarité, de poids moléculaire et de stabilité thermiques et donne ainsi accès aux molécules qui ne peuvent être analyses par CGMS (Polettini,1999).

L’ HPLC-DAD est une méthode de séparation robuste, facile d’emploi, avec des principes de séparation bien connus, et qui permet l’analyser un grand nombre de molécules avec une bonne sensibilité et sélectivité ajustable. Elle est additive et complémentaire à la CGSM et son coût abordable la rend accessible à de nombreux laboratoires de toxicologie  (Kintz,2012).

Chromatographie liquide couplée à un détecteur de masse (LCMS)

 La LCMS permet  l’analyse directe et sans derivatisation d’un grand nombre de composés même polaires et thermolabiles, avec une grande sensibilité et spécificité. De plus, elle requiert un faible volume d’échantillon et une préparation plus simple de celui-ci. Elle constitue donc une bonne alternative aux inconvénients de la GC-MS et HPLC-DAD.

De nos jours, grâce à l’évolution des appareillages et la grande expérience acquise par les analystes, de nombreuses améliorations ont été apportées dans le domaine de la LCMS,  à savoir : l’adaptation et l’optimisation des conditions chromatographiques avec l’utilisation de colonne plus courte et un gradient d’élution afin de réduire le temps d’analyse et la consommation d’éluant , la diminution de la majorité des effets matrices grâce à un traitement d’échantillon spécifique et la standardisation des procédures surtout concernant l’ionisation .

Ainsi, l’analyse par LCMS simple ou en tandem avec electron spray ioisation (ESI) ou encore atmospheric pressure chimical ionization (APCI) a définitivement dépassé l’étape de développement et gagne une place de plus en plus importante dans le screening toxicologique en routine autant pour l’identification que pour la quantification des analytes (Venisse,2003 ; Saint Marcoux,2003 ; Maurer,2010).

Les principaux inconvénients de cette technique sont sans doute son coût trop élevé, la possibilité du phénomène de suppression d’ion à cause des composés endogènes ou des métabolites (compétition lors du processus d’ionisation), mais surtout le manque de standardisation du mode et conditions d’ionisation qui limite la réalisation de librairies spectrale universelles.

La plus part des procédures de screening par LCMS(/MS) sont généralement réalisées en mode SIM (selected ion monitoring) ou MRM (multiple réaction monitoring) et les molécules non incluses a priori dans la librairie locale ne seront pas détectées. Ces méthodes sont donc plus utilisées pour le screening ciblé et la confirmation des résultats obtenus par d’autres méthodes, que le STA général (Maurer,2010). Mais l’avènement des techniques de spectrométrie haute résolution est très prometteur pour le screening toxicologique (Lee ,2009 ; Broecker,2011; Ojanpera ,2012).

Conclusion

Ainsi pour effectuer sa tâche, le toxicologue dispose d’une multitude de techniques analytiques de screening de plus en plus performantes mais aucune ne permet de tout détecter, rapidement et pour un faible coût. Il est donc nécessaire de choisir plusieurs méthodes complémentaires de dépistage et de dosage dont il est impératif de connaitre les avantages et les limites (Tableau.4) pour les intégrer dans une stratégie analytique locale performante adaptée au matériel disponible et dictée par le type et  la quantité de l’échantillon reçu ainsi que le cas à traiter.

 

Méthodes	Avantages	Inconvénients
Colorimétriques	-simple, -rapide, -disponible, -directe, sans prétraitement de l’échantillon	-Nombre très limité de toxiques -Manque de spécificité et e sensibilité -Subjectivité de l’interprétation -Interprétation difficile voir impossible si intoxication polymedicamenteuse. -Nécessite un blanc et un positif à chaque test
Spectro-photométrique	Quantification et/ou  identification spectrale simple et rapide de certains composés.	-Nombre limité de toxiques -Manque de spécificité et de sensibilité -Séparation préalable nécessaire
Enzymatiques	Détection et dosage rapide et simple de certains toxiques ou indicateurs d’intoxication.	-Nombre très restreint de toxiques -Manque de spécificité et beaucoup d’interférences
Immunologiques	-Détection et dosage de certaines molécules ou classes thérapeutiques -Méthodes disponibles, faciles, sensibles, rapides, automatisables, sans prétraitement d’échantillon.	-Cout relativement élevé -Manque de spécificité (nombreuses interférences) -Seuil de positivité parfois supérieures aux concentrations minimales toxiques
CCM	-Matériel simple, disponible, peu couteux -Méthode séparative robuste non destructive, permet l’identification de centaines de molécules et leurs métabolites -Facilite les tests spécifiques d’identification et permet la collection des fractions après séparation -Les nouvelles méthodes sont semi- quantitatives, automatisables et donnent une meilleure identification	-Relativement longue à réaliser -Extraction préalable des analytes nécessaire -manque de sensibilité et de résolution -Influence des conditions locales sur la répétabilité des résultats -Interprétation difficile si intoxication poly-médicamenteuses ou en présence de beaucoup de métabolites. -Pulvérisation de réactifs de révélation toxiques
GC-MS	-Méthode de référence pour la détection et la quantification d’un très large nombre de composés. -Grande résolution, sensibilité, spécificité et reproductibilité -Librairies de spectres de masse de référence très large et universelle	-Coût élève -Personnel bien formé -Traitement d’échantillon long, laborieux et obligatoire -Ne permet pas l’analyse directe des composés peu ou pas volatils, polaires et/ou de haut poids moléculaire
HPLC-DAD	Cf. Article HPLC
LC-MS	-Identification et quantification rapide d’un très large nombre de composés  même polaires et thermolabiles -Grande sensibilité et spécificité. -Faible volume d’échantillon et une préparation plus simple	-Coût élevé -Effets matrices et interférences -Manque de standardisation des librairies de spectres de masse

Tableau 4 Avantages et inconvénients des techniques analytique dans le cadre du STA