Recherche et Dosage des benzodiazépines

Les benzodiazépines (BZD) sont une classe de molécules chimiques hétérocyliques formées d'un cycle diazépine attaché à un benzène. Ces molécules forment ensemble une classe thérapeutique de médicaments psychotropes utilisés dans le traitement des convulsions, de l'agitation psychomotrice de l'anxiété, de l'insomnie, des spasmes, ou dans le contexte d'un syndrome de sevrage alcoolique. Les benzodiazépines agissent principalement sur les neurotransmetteurs neuronaux du Système nerveux central en augmentant leur activité inhibitrice. Par ce mécanisme, les benzodiazépines sont utilisées afin de provoquer un état de sédation et/ou pour leurs propriétés hypnotiques, anxiolytiques, antiépileptiques, amnésiantes et myorelaxantes. ^[1]http://fr.wikipedia.org/wiki/Benzodiaz%C3%A9pine [archive] consulté le … Continue reading L'usage à long terme peut être la cause d'une accoutumance (tolérance), d'une addiction (dépendance) et d'un syndrome de sevrage à l'arrêt brutal de consommation. La première molécule en forme médicamenteuse de la classe des benzodiazépines est apparue dans les années 1960, de nombreuses spécialités voient le jour un peu plus tard dans les années 1970. Leur usage concurrence celui des barbituriques.

Recherche et dosage

Recherche

Recherche par colorimétrie

Principe Coloration spécifique après hydrolyse acide et réaction avec un réactif spécifique  à partir des urines. Réactifs

Acide chlorhydrique 6N. Nitrite de sodium. Sulfamates d'ammonium. Réactif de Tréfouël (Solution .aqueuse de chlorhydrate de N-alpha- Naphtyl N, N diethylpropylène à 0,1%

Matériel

1. Tubes à essais
2. Porte tubes à essais
3. Pipettes
4. Eprouvettes de 10ml

Technique Mettre dans trois tubes à essai 1ml d'urine et 1 ml d'acide chlorhydrique 6N. Introduire les deux derniers au bain marie bouillant pendant 10 minutes, refroidir ces derniers sous un courant d'eau froid puis ajouter dans chaque tube 0,5 ml de sulfamates d'ammonium et 0,5 ml du réactif de Tréfouël. La présence des benzodiazépines se traduit par l'apparition d'un spot violet.

Recherche par spectrophotométrie

Principe Les benzodiazépines sont extraites à partir du sang en milieu acide à PH=6,7 par l'éther. Le dosage consiste à rechercher le maximum d'absorption. Réactifs

Solution tampon à pH =6,7. Soude 0,1N. Acide chlorhydrique 2N.

Matériel

1. Tubes à essais
2. Porte Tubes à essais………………………………….1
3. Ampoule à pied……... ………………………..….……1
4. Verre à décantation…………………………….……..1
5. Micropipettes de 1 ml …………………………..…..1
6. Pipettes

Technique Mélanger :

• 6,5 ml d'éther.
• 1 ml de la solution tampon à pH =6,7.
• 0,5 ml d'eau distillée.
• 1 ml du sang

Agiter au vortex pendant 3 secondes, centrifuger. Mettre le mélange dans une ampoule à décantation, récupérer la phrase éthérée puis rincer cette phase avec:

• 1er avec 3 ml de Na OH 0,1N
• 2ème avec 2 ml d'eau distillée.

Faire un spectre d'absorption dans L'U.V entre (200-400) nm contre HCI 2N.  Résultats:

1. a) Chercher le maximum d'absorption.
2. b) Calculer le coefficient d'extinction molaire.

Recherche par Chromatographie sur couche mince (CCM)

Principe Les dérivés benzodiazépiniques et leurs métabolites présents dans les urines conduisent, par l'action hydrolysante de d'acide chlorhydrique et à 100°C, à la formation de dérivés qui, séparés par chromatographie sur couche mince, permettent l'identification partielle des benzodiazépines mais, surtout, le classement du composé absorbé en fonction de son activité thérapeutique. Réactifs

Acide chlorhydrique pur (d=1,18). Ether éthylique. Acide chlorhydrique N. Sulfate de sodium anhydride. Ethanol à 95°. Nitrite de sodium à 0,5%. Réactif de tréfouel (solution aqueuse à 0,1% de chlorhydrate de N-alpha naphtyl N,N diéthylpropylène).

Matériel

1. Erlenmeyers de 250 ml B.E………………………..2
2. Béchers de 250 ml …………………...………………2
3. Béchers de 100ml…………………………….……….2
4. Ampoules à décantation ……………………..…….2
5. Pipettes (types pasteur).
6. Plaques recouvertes de Silicagel.
7. Lampe ultraviolette.
8. Entonnoirs…………………..........…………………2

Mode opératoire - Préparation des dérivés d’hydrolyses : Dans un erlenmeyer de 250 ml bouchant émeri, placer 5 ml d’urines et 2 ml d’acide chlorhydrique (d= 1,18). Porter le mélange pendant 5 minutes au bain marie à 100°C. Après refroidissement, extraire les produits d’hydrolyse par 10ml d’éther éthylique. Après séparation, la phase éthérée est lavée deux fois avec 5ml de solution aqueuse d’acide chlorhydrique N, puis deux fois avec 5 ml d’eau distillée. Après déshydratation par agitation avec du sulfate de sodium anhydre, l'extrait éthéré est évaporé. La solution dans L'éthanol à 95° du résidu d'évaporation est soumise à l'analyse chromatographique. Analyse chromatographique

1. Absorbant : Couche mince d'oxyde d'aluminium F 254 ; type F, Merk n° 5713/0025 « plaque prêtes à l'emploi conservées en dessiccateur».
2. Substance de référence : Benzophénone : 3/1.
3. Solvant de migration : - Benzène-chloroforme : 3/1.

- Migration : 10 à 12 cm Révélation

• Sous lampe ultraviolette à 254 nm
• Réaction de diazocopulation :

Pulvériser sans excès une solution de nitrite de sodium à 0,5% dans l'acide chlorhydrique (d=1,18) au 1/10 (préparée extemporanément).Attendre 5 minutes. Sécher la plaque sous un courant d'aire tiède. Pulvériser enfin le réactif de Tréfouel « solution aqueuse à 0,1% de chlorhydrate de N-alpha naphtyl N, N-diéthylpropylène diamine ».Les sports correspondant aux amines aromatiques primaires apparaissent en quelques minutes colorés en violet. La coloration s'intensifie plus rapidement en plaçant les plaques de chromatographie à +50°C.

Dosage

Dosage par spectrophotométrie

Principe Hydrolyse acide à chaud des dérivés de la benzo (f) –diazépine- 1,4 et de leurs métabolites dans les liquides biologique, les produits obtenus peuvent être caractérisés par spectrophotométrie après diazocopulation. Réactifs

Salutation de Cholrazépate dipotassique à 100µg/ml Solution d’HCl 6N Solution aqueuse de nitrite de Na à 0.1% (conservation 1 semaine à +4°C) Solution aqueuse de sulfamate d’ammonium à 0.5% Solution aqueuse de dichlorhydrate de nahtyl-éthylène-diamine à 0.1%

Matériel

1. Spectrophotomètre
2. Bain-marie thermostaté (60°C)
3. Bain-marie bouillant

Mode opératoire Dans deux Erlenmeyers :

	Dosage	Etalon
Urines ou Plasma	5ml	-
Solution étalon à 100 µg/ml	-	5ml
HCl 6N	1ml	1ml

• Faire bouillir 45 mn.
• Après refroidissement, alcaliser à pH = 10 et extraire par 20 ml d’éther. Laver l’extrait éthéré par 5 ml de la solution saturée de sulfate de sodium. Sécher la phase organique par un peu de sulfate de sodium sec.
• Evaporer l’éther
• Reprendre par l’HCl 6N :
  • 5 ml (plasma)
  • 5 ml (urines)
  • 5 ml (étalon)

Coloration

	50 µg	100 µg	150 µg	Plasma	Urines	Blanc
Etalon	0.5	1	1.5
Plasma				1.5
Urines					1
HCl 6N	1	0.5			0.5	0.5
Eaud	1	1	1	1	1	1
NaNO2	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Agiter, attendre 3 mn
SulfNH4	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Agiter vigoureusement. Attendre 10 mn en agitant de temps en temps
NED	1	1	1	1	1	1
Agiter, porter à 60°C pendant 5 minutes
Lire les D.O à 550 nmEtablir la courbe d’étalonnage, et lire le taux de benzodiazépines.

Dosage par chromatographie liquide haute performance (HPLC)

La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) —on trouve plus fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) en fonction de l'hydrophobicité et préparative des molécules d'un composé ou d'un mélange de composés. Pour certains, HP signifie « haute pression ».