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Interprétation des spectres, analyse qualitative et quantitative en Spectrophotométrie

En ultraviolette et visible, les mesures spectrophotométriques avec les rayonnements UV ou visibles sont utiles pour détecter des composants qui contiennent des groupes insaturés ou des atomes tels que le soufre ou les halogènes. Un médicament, une impureté ou un métabolite peut également être transformé sélectivement de sorte que le spectre soit déplacé vers la région visible et s’éloigne des interférences causées par un autre médicament, des composants de formulation ou des substances biologiques et confère ainsi un degré de spécificité supplémentaire.

Cependant, l’identification spécifique d’un composé peut rarement être faite sur la seule base des preuves spectrales UV . Souvent, le spectre sert de preuve de confirmation de l’identité, à l’appui d’autres données analytiques. L’approche générale généralement suivie dans les applications qualitatives est d’abord d’établir par des moyens indépendants (par exemple la chromatographie) que le matériau consiste essentiellement en un composant absorbant. Les spectres sont ensuite enregistrés dans une solution aqueuse acide, basique et éthanolique ou méthanolique. Les longueurs d’onde des pics principaux et les valeurs d’absorptivité correspondantes sont notées pour chaque système de solvant. Par comparaison avec les données tabulées dans l’ordre ascendant des longueurs d’onde, un certain nombre de composés ayant des propriétés absorbantes similaires à la substance d’essai sont sélectionnés (en utilisant une fenêtre de longueur d’onde de ± 2 nm). Il faut savoir que, en général, le spectre des métabolites d’un composant correspond étroitement au spectre du composant lui-même.

Des preuves supplémentaires peuvent être déduites des rapports d’absorptivité des pics dans un spectre; de plus, la modification de ces rapports ainsi que le changement des positions de pic lorsque le pH est modifié peuvent être diagnostiques. Si une molécule de médicament s’ionise de façon réversible (ie sans dégradation), la famille des courbes pour une concentration constante dans les solvants acides et basiques présente un ou plusieurs points isosbiens aux longueurs d’onde caractéristiques, pour lesquelles l’absorbance est constante à toutes les valeurs de pH.

Les changements spectraux sont parmi les caractéristiques diagnostiques les plus utiles dans les molécules de médicament qui possèdent des groupes ionisables. Un décalage bathochromique prononcé (ou «déplacement rouge») vers des longueurs d’onde plus longues en solution alcaline est observé non seulement pour la plupart des médicaments phénoliques, tels que les œstrogènes phénoliques, mais aussi pour les hydroxypyridines, cétones, benzodiazépines, pyridones et nitro- composés. Le déplacement bathochrome est souvent important (<10 nm) et s’accompagne d’une augmentation de l’absorptivité molaire ( effet hyperchromique ) et de la perte de toute structure fine.

Cet effet a été exploité, tant à des fins qualitatives que quantitatives, pour l’analyse des barbituriques. En solution acide ou neutre, les barbituriques montrent une faible absorption au-dessus de 230 nm, mais dans le tampon borax 0,05 M (pH 9,2), l’ionisation donne un chromophore conjugué intense avec un maximum bien défini près de 240 nm (A 1 1 = 400 à 450). Dans une solution d’hydroxyde de sodium (pH 13), une deuxième étape d’ionisation se produit (sauf dans les dérivés N- substitués) pour prolonger davantage la conjugaison et donner un pic maximum proche de 255 nm. Cependant, les solutions dans l’alcali sont instables par l’ouverture du cycle, de sorte que les mesures doivent être faites rapidement.

Effet du pH sur le spectre UV du phénobarbital: A, barbiturate non ionisé dans 0,1 mol / acide chlorhydrique, B, mono-anionine 0,05 mol / L de tampon borax pH 9,2; C, di-anion dans 0,5 mol / L d'hydroxyde de sodium pH 13.
Effet du pH sur le spectre UV du phénobarbital: A, barbiturate non ionisé dans 0,1 mol / acide chlorhydrique, B, mono-anionine 0,05 mol / L tampon borax pH 9,2; C, di-anion dans 0,5 mol / L d’hydroxyde de sodium pH 13.

Le passage hypochrome ou «bleu» à des longueurs d’onde plus courtes est montré par les amines aromatiques dans une solution acide et est très caractéristique pour de nombreux médicaments. Lors de l’acidification, le groupe ammonium quaternaire protoné ne participe plus au chromophore, de sorte que le spectre est décalé vers des longueurs d’onde inférieures, parfois jusqu’à 30 nm, avec une chute brutale de l’absorptivité ( effet hypochrome ).

Dissociation des acides barbituriques substitués en C5: (A) acide libre non dissocié; (B) un mono-anion; (C) di-anion.
Dissociation des acides barbituriques substitués en C5: (A) acide libre non dissocié; (B) un mono-anion; (C) di-anion.

En plus de leur utilisation dans la caractérisation d’un chromophore, les décalages induits par le pH peuvent également être exploités pour déplacer un spectre le long de l’échelle de longueur d’onde afin d’obtenir une fenêtre sans interférence pour mesurer une espèce ionisable dans un mélange.

Effets de solvant

Un solvant pour la spectroscopie UV et visible doit être transparent dans toute la région d’intérêt et doit dissoudre une quantité suffisante de l’échantillon pour donner des pics bien définis. De plus, il faut tenir compte des interactions possibles avec les espèces absorbantes. Par exemple, les solvants polaires, tels que l’eau, les alcools, les esters et les cétones, tendent à supprimer la structure fine vibratoire et devraient donc être évités lorsque des détails spectraux sont souhaités. Les solvants non polaires, tels que le cyclohexane, fournissent souvent des spectres qui s’approchent davantage de celui d’un gaz. De plus, la polarité du solvant influence souvent la position des maxima d’absorption. Par conséquent, un solvant commun doit être utilisé lors de la comparaison de spectres à des fins d’identification.

Lors de l’utilisation d’un système HPLC-UV, tout effet sur les caractéristiques spectrales d’une substance induit par différentes phases mobiles doit être pris en compte lors de la comparaison des spectres générés de cette manière avec ceux des solutions acides, neutres et alcalines. De plus, les effets potentiels induits lors de l’élution par gradient HPLC , dans lesquels la composition des phases mobiles est en constante évolution, doivent être pris en compte. Avec l’acétonitrile, le méthanol, l’éthanol, l’isopropanol et d’autres solvants miscibles à l’eau, aucun changement essentiel dans les spectres ne peut se produire et une comparaison directe avec d’autres bases de données est possible. Cependant, les changements de pH peuvent avoir un effet significatif sur les spectres UV des composés impliqués dans un équilibre acido-basique (par exemple les acides carboxyliques, les phénols, les thiophénols) et les composés ayant des atomes d’azote basiques. La comparaison directe des spectres avec d’autres compendiums de données, y compris ceux énumérés dans ce volume, n’est valable que lorsque les phases mobiles ont le même pH.

Spectrofluorimétrie

Pour les composés ayant des propriétés de fluorescence appropriées, cette technique donne une haute sensibilité et une grande spécificité. La haute sensibilité résulte de la différence de longueurs d’onde entre le rayonnement d’excitation et de fluorescence. Ceci résulte en un signal contrasté avec un arrière-plan essentiellement nul; il est toujours plus facile de mesurer un petit signal directement qu’une petite différence entre deux grands signaux, comme c’est le cas en spectrophotométrie d’absorption. La haute spécificité résulte de la dépendance de deux spectres, des spectres d’excitation et d’émission, et de la possibilité de mesurer les durées de vie de l’état fluorescent. Bien que dans des échantillons biologiques l’intensité de fluorescence des substances interférentes puisse être relativement élevée, la sensibilité et la sélectivité du procédé sont généralement telles que les médicaments fluorescents et leurs métabolites peuvent être analysés plus facilement que par spectrophotométrie conventionnelle. Deux composés qui sont excités à la même longueur d’onde, mais émettent à des longueurs d’onde différentes, sont facilement différenciés sans l’utilisation de techniques de séparation chimique. De même, deux composés peuvent fluorescer à la même longueur d’onde mais nécessitent des longueurs d’onde d’excitation différentes. En outre, un composé fluorescent en présence d’un ou plusieurs composés non fluorescents est facilement analysé par fluorimétrie, même lorsque les composés ont des spectres d’absorption qui se chevauchent. Les composés non fluorescents ou faiblement fluorescents peuvent souvent réagir avec des fluorophores forts, ce qui permet de les déterminer quantitativement.

De nombreuses espèces fluorescentes contiennent des groupes ionisables avec des propriétés fluorescentes sensibles au pH. Dans certains cas, une seule des espèces ionisées peut être fluorescente. Des exemples sont les barbituriques qui ne fluorescent qu’à pH élevé sous forme dianionique. Le phénol fluorescent à pH 7, mais à pH 12, lorsqu’il est converti en son anion, il n’y a pas de fluorescence. Par conséquent, la relation entre l’intensité de la fluorescence et le pH devrait toujours être examinée dans le cadre du développement de la méthode.

L’intensité de la fluorescence et la longueur d’onde varient souvent avec le solvant. Dans la plupart des molécules, la fluorescence diminue avec une diminution de la viscosité du solvant, car la probabilité de transfert d’énergie intermoléculaire a tendance à être améliorée. Le même effet se produit avec une augmentation de la température.

Analyse quantitative – spectrophotométrie ultraviolette et visible

Base fondamentale

Le principe de base de la plupart des mesures spectrophotométriques consiste à comparer, dans des conditions bien définies, l’absorption du rayonnement par la substance dans une quantité inconnue avec la même absorption de rayonnement par une quantité connue du matériau à déterminer. En général, pour obtenir la sensibilité maximale, il est préférable de travailler avec un rayonnement d’une longueur d’onde approximativement égale à celle pour laquelle la solution présente une absorption sélective maximale.

En supposant que la plage linéaire de conformité à la loi de Beer-Lambert a été établie et que la concentration de médicament a été ajustée dans la gamme optimale pour le type d’instrument concerné, deux approches de quantification peuvent être employées. Si un étalon de référence acceptable du médicament est disponible, et si le graphique d’étalonnage passe à zéro, la mesure des répétitions de l’étalon (à concentration comparable) et des essais est effectuée en séquence de bracketing (chaque groupe d’échantillons est précédé et suivi de la norme), dans des conditions identiques de solvant et de température et en utilisant la même paire de cellules appariées. Chaque résultat devrait être corrigé pour la constante de cellule; la concentration de l’échantillon d’essai est ensuite déterminée par référence aux résultats des étalons.

En variante, l’absorbance spécifique est utilisée pour calculer la concentration de l’échantillon, en utilisant l’absorbance mesurée dans le solvant spécifié. Une vérification de la précision de l’échelle d’absorbance est clairement essentielle. La précision de la longueur d’onde n’est pas si importante.

L’utilité pratique des valeurs d’absorbance spécifiques à la référence ( A 1 1 ) dépend clairement d’un certain nombre de facteurs. Ceux-ci comprennent l’état de pureté de la substance, les conditions de solvant utilisées à l’origine pour établir les données de référence, les conditions précises utilisées dans l’instrument de référence et la mesure dans laquelle elles correspondent à celles d’un laboratoire d’essai particulier. Il est donc sage de vérifier l’état de toutes les données d’absorptivité dans la littérature. Dans les monographies de la partie 2, la fiabilité de toutes les valeurs A 1 1 a été évaluée et indiquée (voir les avis généraux). Toutefois, si un échantillon du médicament concerné est disponible sous forme pure, il est recommandé d’établir périodiquement une valeur «locale» de l’absorptivité et de l’utiliser pour calculer les concentrations d’échantillons.

Problèmes de linéarité

La validité de la loi Beer-Lambert devrait être établie pour chaque médicament dans les conditions de mesure à utiliser sur une plage de concentration appropriée. Pour les instruments à faisceau unique, la plage d’absorbance pour des mesures précises est comprise entre environ 0,3 et 0,6 unité d’absorbance, l’optimum étant de 0,43 unité d’absorbance. Pour les spectrophotomètres à double faisceau, la plage optimale se situe entre 0,6 et 1,2 unités d’absorbance. Cinq solutions étalons ou plus, avec des absorbances couvrant toute la plage de travail, doivent être mesurées en double dans une paire de cellules appariées contre le solvant comme référence; la différence d’absorbance résiduelle entre les cellules lorsqu’elles sont remplies de solvant (la constante de cellule) doit être soustraite de chaque mesure individuelle et contrôlée régulièrement.

La linéarité d’une méthode analytique est déterminée par un traitement mathématique des données d’absorbance des solutions étalons dans l’intervalle revendiqué de la méthode. Le traitement est normalement un calcul d’une ligne de régression y = a x + b , avec y étant l’absorbance et x la concentration, par la méthode des moindres carrés. La linéarité est généralement exprimée au moyen d’un coefficient de corrélation r , où:

pour tous les n points avec i de l’unité à n .

Quand r = 1, il y a une corrélation parfaite. Habituellement, des valeurs r supérieures à 0,995 peuvent être obtenues.

L’interception ne devrait pas différer significativement de zéro. Si une interception non nulle significative est obtenue, il doit être démontré qu’il n’y a aucun effet sur l’exactitude de la méthode.

Fréquemment, la linéarité est évaluée graphiquement en plus ou en alternative à une évaluation mathématique.L’évaluation est faite par inspection visuelle d’un graphique de l’absorbance A en fonction de la concentration de l’analyte c . Si une déviation systématique positive ou négative est trouvée, des points supplémentaires doivent être insérés et la plage de travail linéaire doit être établie.

Les écarts par rapport à la linéarité sont parfois difficiles à détecter, deux procédures graphiques supplémentaires peuvent donc être utilisées. La première consiste à tracer les écarts par rapport à la ligne de régression par rapport à la concentration ou au logarithme de la concentration, si l’intervalle de concentration couvre plusieurs décennies. Pour les plages linéaires, l’écart doit être réparti également entre les valeurs positives et négatives.

Une autre approche consiste à tracer la fonction A / bc (l’absorptivité) sur l’axe y et les concentrations correspondantes sur l’axe x . La ligne obtenue doit être horizontale sur toute la gamme linéaire. Des lignes horizontales parallèles sont dessinées sur le graphique qui correspondent, par exemple, à 95% et 105% de la ligne horizontale. La méthode est alors linéaire jusqu’au point où la ligne de réponse relative tracée croise l’une de ces deux lignes.

Critères de validation de la Conférence internationale sur l’harmonisation

L’objectif principal de la validation d’une procédure analytique est de démontrer que la procédure est adaptée à l’usage auquel elle est destinée. L’objectif d’une procédure analytique doit être clairement compris, car cela déterminera les caractéristiques de validation qui doivent être évaluées. Les caractéristiques de validation typiques à considérer selon la Conférence Internationale sur l’Harmonisation des Exigences Techniques d’Enregistrement des Produits Pharmaceutiques à Usage Humain ( ICH ) sont: exactitude, précision (répétabilité et précision intermédiaire), spécificité, limite de détection, limite de quantification, linéarité et portée . Toutes ces caractéristiques sont également énumérées et expliquées dans l’USP 25 (USP 2002). Pour la détermination quantitative des impuretés, tous ces critères doivent être évalués, tandis que pour les essais limites, la spécificité et la limite de détection sont les plus pertinentes. Pour les dosages, toutes les caractéristiques sauf la limite de détection et la limite de quantification sont normalement évaluées.

Pour la linéarité, l’ ICH recommande un minimum de cinq concentrations à mesurer. La plage est allouée les limites suivantes:

  • Pour le dosage d’une substance médicamenteuse ou d’un produit fini (médicament) – normalement de 80 à 120% de la concentration d’essai.
  • Pour l’uniformité de la teneur – couvrant au moins 70 à 130% de la concentration d’essai, à moins qu’une gamme plus large et plus appropriée, basée sur la nature de la forme posologique (par exemple inhalateurs doseurs), soit justifiée.
  • Pour les tests de dissolution – ± 20% sur la plage spécifiée.
  • Pour la détermination d’une impureté – du niveau de déclaration d’une impureté à 120% de la spécification.
  • Si le dosage et la pureté sont effectués ensemble comme un test et que seule une norme de 100% est utilisée, la linéarité doit couvrir la gamme allant du niveau de déclaration des impuretés à 120% de la spécification du test.

Pour déterminer l’exactitude, un minimum de neuf déterminations sur un minimum de trois niveaux de concentration qui couvrent la gamme spécifiée est recommandée.

La répétabilité doit être évaluée en utilisant un minimum de neuf déterminations qui couvrent la gamme spécifiée pour la procédure (par exemple trois concentrations avec trois répétitions chacune) ou un minimum de six déterminations à 100% de la concentration d’essai.

Pour déterminer la limite de détection, les recommandations de l’ ICH correspondent à l’USP 25 (USP 2002) et peuvent être déterminées, par exemple, sur la base de rapports signal / bruit, où 2: 1 ou 3: 1 est généralement accepté, ou écart type de l’ébauche.

Pour calculer la limite de quantification, l’ ICH et l’USP 25 (USP 2002) recommandent un rapport signal / bruit de 10: 1. L’USP 25 (USP 2002) et l’ ICH recommandent explicitement la validation de la limite de quantification par l’analyse d’un nombre approprié d’échantillons connus pour être proches ou préparés à la limite de quantification.

Analyse quantitative – fluorimétrie

Base fondamentale

Les spectres d’excitation sont généralement utilisés pour confirmer l’identité des composants et pour sélectionner une longueur d’onde d’excitation optimale pour l’analyse quantitative. Le spectre d’émission est ensuite utilisé pour des applications analytiques.

La spectrofluorimétrie diffère de la spectrophotométrie d’absorption en ne donnant pas une échelle de valeurs absolue, car elle dépend du nombre de molécules excitées et de leur méthode de relaxation. Pour cette raison, il est essentiel d’utiliser une norme de référence pour les mesures quantitatives.

La relation linéaire entre la puissance de fluorescence et la concentration du soluté fluorescent constitue la base de la quantification, la constante de linéarité pouvant être établie par étalonnage avec des étalons. Un graphique des lectures de fluorescence par rapport à la concentration des solutions de référence fournit la courbe d’étalonnage. Les filtres de référence en verre conviennent également comme étalon d’étalonnage.

Linéarité et problèmes de base

En solution diluée, l’intensité de fluorescence ( I f ) pour des valeurs définies de λ ex et λ f est liée linéairement à la concentration molaire ( c ), selon la relation approximative:

I f = Kc à λ ex , λ f

dans des conditions instrumentales constantes.

La sensibilité peut être augmentée en travaillant à des puissances d’excitation élevées pour donner des rapports signal / bruit plus élevés. Comme l’intensité de la source peut changer de temps à autre, les signaux de fluorescence ne sont pas mesurés en tant que paramètres absolus. Ils sont exprimés plutôt en termes de fluorescence relative. Toutes les mesures sont effectuées par rapport à des étalons de référence de concentration connue. Toutes les lectures doivent être corrigées pour la fluorescence de fond.

Une condition nécessaire est que l’absorbance totale (= ε bc ) du système ne dépasse pas 0,05 unité d’absorbance; sinon, des écarts négatifs progressivement plus grands par rapport à la linéarité sont observés.À des concentrations élevées de médicament, l’intensité de la fluorescence atteint un plateau. Au-delà, l’intensité de la fluorescence diminue avec l’augmentation de la concentration, en raison des effets du filtre interne, dans lequel les molécules de l’état fondamental absorbent la fluorescence émise par les molécules excitées.

Il est essentiel d’établir la plage de linéarité de la courbe d’étalonnage de I f en fonction de c , en utilisant au moins cinq solutions étalons, pour lesquelles la condition d’absorbance à la longueur d’onde d’excitation maximale est <0,05 unités d’absorbance. Les échantillons sont généralement analysés par bracketing en un point, en prenant un standard proche de la valeur d’échantillon prévue et en calculant le résultat par une simple proportion.

La séquence de mesures standard avant et après la mesure de l’échantillon permet de compenser toute dérive de la ligne de base. Pour une sécurité d’essai supplémentaire, un bracketing à deux points peut être utilisé, dans lequel deux solutions étalons, l’une supérieure et l’autre inférieure à la concentration observée pour l’échantillon, sont utilisées dans la séquence de bracketing.

Les limitations instrumentales causées par l’instabilité de la source radiative peuvent être surmontées par le fonctionnement en mode rapport. Une petite fraction du rayonnement d’excitation est dirigée vers un photodétecteur de référence, qui est choisi principalement pour la réponse à large longueur d’onde. Le signal de sortie est utilisé comme moniteur et, lorsque le rayonnement d’excitation augmente ou diminue en raison des fluctuations de la source, il y a une augmentation ou une diminution correspondante de la fluorescence relative.

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