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La spectroscopie d’absorption analytique dans les régions de l’ultraviolet (UV) et le visible du spectre électromagnétique a été largement utilisée dans l’analyse pharmaceutique et biomédicale à des fins quantitatives et, avec certaines limites, pour la caractérisation des médicaments, impuretés, métabolites et substances apparentées. En revanche, les méthodes de luminescence, et en particulier la spectroscopie de fluorescence, ont été moins largement exploitées, en dépit des avantages incontestables d’une plus grande spécificité et d’une sensibilité communément observée pour les espèces fluorescentes. Cependant, la plus grande disponibilité de spectrofluorimètres capables de présenter des spectres d’excitation et d’émission corrigés, couplée au fait que des réactions fluorogènes fiables permettent d’examiner fluorimétriquement des espèces non fluorescentes, a conduit à une renaissance de l’intérêt pour les méthodes fluorimétriques en analyse biomédicale.

Spectrophotométrie UV et visible – Considérations générales

L’absorption moléculaire dans la région UV et visible provient des transitions d’énergie qui impliquent les électrons orbitaux ou de valence externes. Les spectres dans les milieux liquides sont généralement des bandes larges et relativement sans relief, résultat du grand nombre de transitions vibrationnelles et rotationnelles étroitement espacées. La forme de la bande fondamentale se rapproche des courbes gaussiennes ou log-normales. Étant donné les profils larges et chevauchants couramment rencontrés, la forme et la localisation précise des bandes individuelles sont d’une utilité limitée dans l’analyse qualitative. Cependant, toute structure fine détectée dans les spectres, couplée à des effets de solvant et de pH, peut avoir une valeur diagnostique. Des spectres plus informatifs peuvent être obtenus pour certaines molécules volatiles d’intérêt toxicologique, telles que le benzène et les hydrocarbures aromatiques polynucléaires; Quand on l’examine en phase vapeur, la structure fine vibratoire et rotationnelle peut être facilement vue superposée aux larges profils spectraux. Ceci est illustré sur la figure 1 pour la 1,2,4,5-tétrazine. Cependant, la plupart des médicaments, des métabolites et des composés apparentés sont relativement non volatils; leurs spectres sont observés nécessairement en solution, ou éventuellement en phase solide par réflectance, ou par compression pour former un disque de KBr, tel qu’utilisé en spectrophotométrie infrarouge.

La spectrophotométrie UV et visible trouve sa principale application dans l’analyse quantitative. La portée de la spectroscopie d’absorption peut être étendue de manière significative en utilisant des réactions colorimétriques, souvent avec une augmentation concomitante de la sensibilité et / ou de la sélectivité. De telles réactions sont utilisées pour modifier le spectre d’une molécule absorbante afin qu’elle puisse être détectée dans la région visible, bien séparée des autres composants interférents dans le spectre UV. De plus, une modification chimique peut être utilisée pour transformer une molécule par ailleurs non absorbante en un dérivé stable qui possède une absorption significative.

La sélectivité spectrale peut encore être améliorée par un certain nombre de techniques chimiques ou instrumentales, qui comprennent la spectrophotométrie différentielle, à dérivée élevée et à double longueur d’onde. De telles méthodes, et certaines techniques graphiques telles que la méthode de Morton-Stubbs, peuvent contribuer de différentes manières à réduire le problème général de l’interférence spectrale en spectroscopie quantitative. L’interférence spectrale peut provenir de l’absorption non spécifique dite «non pertinente», ainsi que de l’absorption par d’autres matériaux et des impuretés qui peuvent être présents. Lorsque l’interférence provient spécifiquement du chevauchement spectral de deux ou plusieurs composants bien définis, un certain nombre de méthodes peuvent être appliquées pour mesurer les concentrations individuelles. Ces méthodes comprennent la technique à multi-longueurs d’onde de Vierordt.

La sélectivité spectrale et, dans certains cas, la sensibilité de détection, peuvent être améliorées de manière significative par les diverses techniques chimiques et instrumentales décrites ci-dessus. Ces méthodes devraient, bien sûr, être validées en appliquant les critères analytiques conventionnels de précision (par rapport à une méthode de référence), de linéarité, de précision et d’indépendance vis-à-vis des substances interférentes.

La portée de la spectrophotométrie UV et visible peut être encore étendue lorsqu’elle est combinée avec une étape de séparation chromatographique, telle que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le développement de détecteurs à balayage rapide basés sur le réseau de photodiodes linéaires permet d’acquérir des spectres lors de l’élution des pics. La manipulation assistée par ordinateur de ces spectres a conduit à de nouvelles stratégies pour l’examen de l’homogénéité des pics chromatographiques, basées sur des techniques classiques en spectroscopie. L’utilisation de micro-ordinateurs permet le développement de méthodes de recherche pour la caractérisation spectrale (Fell et al., 1984).

Nomenclature

Dans le spectre UV et visible, l’énergie des photons associée aux transitions électroniques est comprise entre 147 et 630 kJ / mol. Cette énergie (Δ E ) peut être exprimée en fonction des paramètres principaux qui définissent le rayonnement électromagnétique, à savoir la fréquence μ (Hz), la longueur d’onde λ (nm) et le nombre d’onde (cm -1 ):

où h est la constante de Planck, et c est la vitesse du rayonnement sous vide .

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