La spectroscopie d'absorption analytique dans les régions de l'ultraviolet (UV) et le visible du spectre électromagnétique a été largement utilisée dans l'analyse pharmaceutique et biomédicale à des fins quantitatives et, avec certaines limites, pour la caractérisation des médicaments, impuretés, métabolites et substances apparentées. En revanche, les méthodes de luminescence, et en particulier la spectroscopie de fluorescence, ont été moins largement exploitées, en dépit des avantages incontestables d'une plus grande spécificité et d'une sensibilité communément observée pour les espèces fluorescentes. Cependant, la plus grande disponibilité de spectrofluorimètres capables de présenter des spectres d'excitation et d'émission corrigés, couplée au fait que des réactions fluorogènes fiables permettent d'examiner fluorimétriquement des espèces non fluorescentes, a conduit à une renaissance de l'intérêt pour les méthodes fluorimétriques en analyse biomédicale.
où h est la constante de Planck, et c est la vitesse du rayonnement sous vide .
Puisque seule la capacité d'absorption ( k ) est fonction de λ , la forme d'une courbe d'absorption logarithmique est indépendante de la concentration et de la longueur du trajet. Leur seul effet est de décaler le spectre log A le long de l'axe log A. Un inconvénient de la notation Un graphique est que la structure fine près du sommet du pic est compressée.
Spectrophotométrie UV et visible - Considérations générales
L'absorption moléculaire dans la région UV et visible provient des transitions d'énergie qui impliquent les électrons orbitaux ou de valence externes. Les spectres dans les milieux liquides sont généralement des bandes larges et relativement sans relief, résultat du grand nombre de transitions vibrationnelles et rotationnelles étroitement espacées. La forme de la bande fondamentale se rapproche des courbes gaussiennes ou log-normales. Étant donné les profils larges et chevauchants couramment rencontrés, la forme et la localisation précise des bandes individuelles sont d'une utilité limitée dans l'analyse qualitative. Cependant, toute structure fine détectée dans les spectres, couplée à des effets de solvant et de pH, peut avoir une valeur diagnostique. Des spectres plus informatifs peuvent être obtenus pour certaines molécules volatiles d'intérêt toxicologique, telles que le benzène et les hydrocarbures aromatiques polynucléaires; Quand on l'examine en phase vapeur, la structure fine vibratoire et rotationnelle peut être facilement vue superposée aux larges profils spectraux. Ceci est illustré sur la figure 1 pour la 1,2,4,5-tétrazine. Cependant, la plupart des médicaments, des métabolites et des composés apparentés sont relativement non volatils; leurs spectres sont observés nécessairement en solution, ou éventuellement en phase solide par réflectance, ou par compression pour former un disque de KBr, tel qu'utilisé en spectrophotométrie infrarouge. La spectrophotométrie UV et visible trouve sa principale application dans l'analyse quantitative. La portée de la spectroscopie d'absorption peut être étendue de manière significative en utilisant des réactions colorimétriques, souvent avec une augmentation concomitante de la sensibilité et / ou de la sélectivité. De telles réactions sont utilisées pour modifier le spectre d'une molécule absorbante afin qu'elle puisse être détectée dans la région visible, bien séparée des autres composants interférents dans le spectre UV. De plus, une modification chimique peut être utilisée pour transformer une molécule par ailleurs non absorbante en un dérivé stable qui possède une absorption significative. La sélectivité spectrale peut encore être améliorée par un certain nombre de techniques chimiques ou instrumentales, qui comprennent la spectrophotométrie différentielle, à dérivée élevée et à double longueur d'onde. De telles méthodes, et certaines techniques graphiques telles que la méthode de Morton-Stubbs, peuvent contribuer de différentes manières à réduire le problème général de l'interférence spectrale en spectroscopie quantitative. L'interférence spectrale peut provenir de l'absorption non spécifique dite «non pertinente», ainsi que de l'absorption par d'autres matériaux et des impuretés qui peuvent être présents. Lorsque l'interférence provient spécifiquement du chevauchement spectral de deux ou plusieurs composants bien définis, un certain nombre de méthodes peuvent être appliquées pour mesurer les concentrations individuelles. Ces méthodes comprennent la technique à multi-longueurs d'onde de Vierordt. La sélectivité spectrale et, dans certains cas, la sensibilité de détection, peuvent être améliorées de manière significative par les diverses techniques chimiques et instrumentales décrites ci-dessus. Ces méthodes devraient, bien sûr, être validées en appliquant les critères analytiques conventionnels de précision (par rapport à une méthode de référence), de linéarité, de précision et d'indépendance vis-à-vis des substances interférentes. La portée de la spectrophotométrie UV et visible peut être encore étendue lorsqu'elle est combinée avec une étape de séparation chromatographique, telle que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le développement de détecteurs à balayage rapide basés sur le réseau de photodiodes linéaires permet d'acquérir des spectres lors de l'élution des pics. La manipulation assistée par ordinateur de ces spectres a conduit à de nouvelles stratégies pour l'examen de l'homogénéité des pics chromatographiques, basées sur des techniques classiques en spectroscopie. L'utilisation de micro-ordinateurs permet le développement de méthodes de recherche pour la caractérisation spectrale (Fell et al., 1984).Nomenclature
Dans le spectre UV et visible, l'énergie des photons associée aux transitions électroniques est comprise entre 147 et 630 kJ / mol. Cette énergie (Δ E ) peut être exprimée en fonction des paramètres principaux qui définissent le rayonnement électromagnétique, à savoir la fréquence μ (Hz), la longueur d'onde λ (nm) et le nombre d'onde (cm -1 ):
où h est la constante de Planck, et c est la vitesse du rayonnement sous vide .
Les positions des pics sont parfois décrites en termes de nombre d'onde, ce qui a l'avantage d'être une fonction linéaire de l'énergie, mais ce terme est beaucoup plus fréquemment utilisé en spectrophotométrie infrarouge.L'unité la plus utilisée en spectrophotométrie UV et visible est la longueur d'onde, généralement exprimée en nanomètres (nm). Les anciennes unités de longueur d'onde, millimicron (mμ) et ångström (Å), ne sont pas des termes recommandés. La position d'absorbance maximale d'un pic est désignée par λ max .
La plage de longueur d'onde est classiquement divisée en deux plages: les UV s'étendent de 200 nm à environ 400 nm; la plage visible s'étend d'environ 400 nm à 800 nm. En dehors de ces limites, le «rayonnement UVlointain» ou « UV sous vide» s'étend de 100 nm à 200 nm et le «proche infrarouge» de 1 μm à environ 3 μm.
Un groupement moléculaire spécifiquement responsable de l'absorption est décrit comme un chromophore, et est généralement un système conjugué avec une délocalisation extensive de la densité électronique. Tout groupe saturé avec une absorption intrinsèque faible ou nulle, mais qui modifie le spectre d'absorption lorsqu'il est attaché directement à un chromophore, est décrit comme un auxochrome, des exemples étant -OR, -NR2, -SR. On considère que les auxochromes exercent leur effet par conjugaison partielle de leurs électrons à paire unique polarisables avec ceux du chromophore adjacent. Si, cependant, la paire d'électrons isolée est impliquée dans la liaison comme, par exemple, dans le cas d'un groupe ammonium quaternaire protoné, l'effet auxochromique disparaît. Cette propriété peut être utilisée pour la caractérisation moléculaire, comme discuté ci-dessous.
Lois de la spectrophotométrie d'absorption
Le degré d'absorption du rayonnement par un système absorbant à une longueur d'onde monochromatique donnée est décrit par les deux lois classiques de l'absorptiométrie, qui relient l'intensité du rayonnement incident sur le système absorbant ( I 0 ) à l'intensité transmise ( I ), 2). La loi de Lambert (ou de Bouguer) concerne les facteurs instrumentaux et indique qu'à une concentration donnée ( c ) d'un système absorbant homogène, l'intensité transmise ( I ) décroît exponentiellement avec l'augmentation de la longueur du trajet ( b). La loi de Beer complémentaire traite de la concentration et indique que pour une couche de longueur de trajet définie ( b ), l'intensité transmise ( I ) diminue exponentiellement avec l'augmentation de la concentration ( c ) d'un système absorbant homogène. La combinaison de ces observations donne la loi de Beer-Lambert:
Le terme logarithmique est lié linéairement à la concentration et à la longueur du trajet, et est appelé absorbance ( A ). Les termes plus anciens, extinction ( E ) et densité optique ( DO ) ne sont pas recommandés, bien qu'ils soient souvent trouvés dans la littérature. La transmittance ( T = I / I 0 ) et le pourcentage de transmittance [ % T = 100 ( I / I 0 )] ne sont pas des fonctions linéaires de concentration et de longueur de trajet et peuvent être facilement liés à l'absorbance:
Lorsque la concentration est exprimée en g / 100 mL, k est décrit comme l'absorbance spécifique et reçoit le symbole A 1% 1cm ou A (1%, 1 cm), défini comme «l'absorbance d'une solution à 1% p / v dans un cellule de 1 cm de longueur de trajet ». Il est généralement écrit sous la forme raccourcie A 1 1 et est largement utilisé en chimie analytique. Il était auparavant connu sous le nom de «coefficient d'extinction spécifique», symbole E 1%1cm ou E (1%, 1 cm).
La convention américaine reconnaît la constante k comme «absorptivité» ( a , L / g / cm) définie comme «l'absorbance d'une solution à 1 g / L dans une cellule de 1 cm de longueur de trajet».
Ces termes d'absorptivité peuvent être facilement interconvertis:
L'absorbance et l'absorptivité sont souvent exprimées sous forme logarithmique dans les cas où les spectres doivent être comparés. La forme logarithmique de la loi de Beer-Lambert exprime les effets de l'absorptivité ( k), de la concentration ( c ) et de la longueur du trajet ( b ) comme termes additifs.
Validité de la loi Beer-Lambert
La validité de la loi Beer-Lambert est affectée par un certain nombre de facteurs. Si le rayonnement est non monochromatique, c'est-à-dire que sa bande passante spectrale est supérieure à environ 10% de la bande passante d'absorption du médicament à mi-hauteur, l'absorbance observée sera inférieure à la vraie valeur limite pour le rayonnement monochromatique. Ainsi, les bandes aiguës sont plus sensibles que les bandes larges à l'erreur d'absorbance sur ce compte. De plus, si l'espèce absorbante est non homogène ou si elle subit une association, une dissociation, une photodégradation, une solvatation, une complexation ou une adsorption, ou si elle émet une fluorescence, des écarts positifs ou négatifs à la loi de Beer-Lambert peuvent être observés. Les effets de lumière parasite et le type de solvant utilisé peuvent également conduire à un non-respect de la loi Beer-Lambert.
Effets de lumière parasite
La lumière parasite est un rayonnement à des longueurs d'onde différentes de celles souhaitées. Il peut provenir de la diffusion de la lumière ou d'autres défauts dans l'instrument, ou il peut être causé par un rayonnement externe. Si la lumière parasite n'est pas absorbée, l'absorbance observée tend vers une valeur constante lorsque la concentration de médicament augmente, ce qui donne un écart négatif par rapport à la loi de Beer-Lambert. Les erreurs de lumière parasite sont plus susceptibles d'être observées près des limites de longueur d'onde d'un instrument, où l'intensité de rayonnement de la source et l'efficacité du système optique sont réduites, en particulier en dessous de 220 nm et au point de croisement entre UV et lampes visibles (environ 320 à 400 nm). Les erreurs peuvent devenir sérieuses si le solvant absorbe fortement ou si un échantillon fortement absorbant est mesuré par spectrophotométrie différentielle.Effets de solvant
Le solvant exerce souvent une profonde influence sur la qualité et la forme du spectre. Par exemple, de nombreux chromophores aromatiques présentent une structure fine vibrationnelle dans les solvants non polaires, alors que dans les solvants plus polaires, cette structure fine est absente en raison des effets d'interaction soluté-solvant. Un cas classique est le phénol et les composés apparentés, qui ont des spectres différents dans le cyclohexane et dans une solution aqueuse neutre. Dans les solutions aqueuses, le pH exerce un effet profond sur les chromophores ionisables en raison de l'étendue différente de la conjugaison dans le chromophore ionisé et non ionisé. La qualité de la mesure spectrale est directement influencée par le type et la pureté du solvant utilisé. Chaque solvant a une longueur d'onde de coupure (qui correspond à environ 10% de transmittance) et cela varie avec la pureté du solvant. Un solvant ne doit pas être utilisé en dessous de sa longueur d'onde de coupure, même si une compensation de cellule de référence est utilisée, en raison du plus grand risque d'effets de lumière parasite. Certains commentaires d'avertissement peuvent être appropriés à ce stade. Il est préférable d'utiliser de l'eau à simple ou double distillation et d'éviter l'eau désionisée, qui peut être contaminée par des fragments absorbants de résine échangeuse d'ions ou contenir des métabolites bactériens; ceux-ci peuvent contribuer de manière significative à l'absorption non spécifique à de faibles longueurs d'onde. L'éthanol est normalement utilisé comme une concentration de 96% v / v, puisque l'alcool déshydraté est habituellement contaminé avec des traces de benzène ajoutées pour former le mélange azéotropique pour la distillation. L'acétonitrile peut varier sensiblement en qualité, selon le fournisseur; la qualité fournie pour une utilisation en HPLC est généralement recommandée. L'acétone, parfois utilisée pour nettoyer les cellules, est très absorbante et n'est pas toujours facilement éliminée, malgré sa volatilité et sa solubilité dans l'eau. Le chloroforme et le tétrachlorure de carbone absorbent fortement à environ 250 nm et ne doivent donc être utilisés que pour des mesures à des longueurs d'onde supérieures à environ 280 nm. Compte tenu des considérations de sécurité des solvants chlorés, l'utilisation de ceux-ci est préférable d'éviter si possible. L'éther, bien que transparent jusqu'à 220 nm, présente des problèmes particuliers en raison de sa volatilité (solutions étalons instables) et de son inflammabilité. Bien que l'absorptivité soit considérée comme relativement insensible aux changements de température, les solvants organiques en général souffrent de coefficients de dilatation à température élevée, de sorte que pour une précision ultime, une cellule munie d'un thermostat peut être nécessaire.Was this article helpful?
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Last modified: 7 novembre, 2017
