Spectrophotométrie dans l’ultraviolet et le visible – Fluorimétrie

Fluorimétrie et Spectrophotométrie dans l’ultraviolet et le visible.

Colorimètres

Les colorimètres utilisent habituellement une seule source de rayonnement de tungstène en combinaison avec des filtres optiques à large bande (environ 30 nm) de longueur d’onde nominale ou des filtres interférentiels à largeur de bande étroite avec une longueur d’onde définie pour utilisation dans le visible. La gamme de linéarité du colorimètre peut être limitée par les bandes passantes spectrales relativement larges, et doit donc être soigneusement vérifiée pour chaque type de dosage.

Spectrophotomètres à faisceau unique

Ces dispositifs diffèrent du colorimètre, un prisme ou un monochromateur de réseau de diffraction de haute qualité est utilisé, ainsi qu’une source intense supplémentaire de rayonnement UV, généralement une lampe au deutérium (ou à l’hydrogène). Ils sont capables de haute précision, en particulier dans la plage d’absorbance optimale (0,3 à 0,6 unités d’absorbance). Les cellules de référence et d’échantillonnage doivent être déplacées manuellement à l’intérieur et à l’extérieur du faisceau de rayonnement à chaque longueur d’onde, il n’est donc pas possible de scanner un spectre à l’aide d’un tel dispositif.

Spectrophotomètres à double faisceau

Les spectrophotomètres à double faisceau utilisent des composants optiques de haute qualité similaires à ceux de l’instrument à faisceau unique. Cependant, le rayonnement du monochromateur est divisé en deux faisceaux identiques par un miroir rotatif. Un faisceau traverse l’échantillon et l’autre traverse la cellule de référence, avant d’être recombiné pour se concentrer au niveau du détecteur. Chaque signal est traité de manière appropriée par l’électronique du détecteur pour mesurer l’absorbance 10 à 20 fois par seconde, ce qui donne une compensation complète pour l’absorption des cellules et des solvants. Un moteur de balayage entraîne le monochromateur pour donner un changement de longueur d’onde constant par seconde, qui est synchronisé avec un enregistreur ou un traceur numérique pour présenter le spectre. Pour les bandes larges, des vitesses de balayage allant jusqu’à 2 nm / s peuvent être utilisées. Cependant, certains spectrophotomètres contrôlés par ordinateur avec des capacités de traitement de données rapides peuvent scanner à des vitesses avoisinant les 20 nm / s, tout en conservant une fidélité spectrale même pour des pics nets.

Spectrophotomètres à barrettes de diodes

Les Spectrophotomètres à barrettes de diodes utilisent des détecteurs multicanaux. Le détecteur le plus courant de ce type est le réseau de photodiodes linéaires. Le mode optique inverse est utilisé, de sorte que le rayonnement soit passé à travers l’échantillon ou la cellule de référence, puis dispersé par un polychromateur à réseau de diffraction et détecté par un dispositif qui comprend plusieurs centaines de diodes. Chaque photodiode enregistre l’intensité intégrée du rayonnement incident sur elle, qui est déterminée par le rapport dispersion spectrale: photodiode. Si, par exemple, une bande passante de 200 nm est dispersée sur 256 photodiodes, la résolution nominale par photodiode est de 0,78 nm.

Un spectre dans une gamme spécifiée est acquis en 20 ms. Les signaux analogiques de chaque photodiode sont numérisés et transférés vers un ordinateur, où ils sont corrigés pour la réponse à l’obscurité et transformés en absorbance. Un certain nombre de techniques numériques sont disponibles pour augmenter la sensibilité, en étendant l’utilisation de détecteurs à balayage rapide à l’analyse multicomposant, la cinétique de réaction, les tests de dissolution des comprimés, le contrôle et la détection en HPLC (Fell et al 1982).

Fluorimétrie

Fluorimètres à faisceau unique

Un spectrofluorimètre à faisceau unique consiste en une source de rayonnement (généralement une lampe au mercure ou au xénon), un filtre primaire (excitation), une cellule d’échantillonnage, un filtre secondaire (émission) et un système de détection de fluorescence. Dans la plupart de ces fluorimètres, le détecteur est placé sur un axe à 90 ° de celui du faisceau d’excitation. Cette géométrie à angle droit permet au rayonnement d’excitation de traverser l’échantillon d’essai et de ne pas contaminer le signal de sortie reçu par le détecteur de fluorescence. Cependant, le détecteur reçoit inévitablement une partie du rayonnement d’excitation en raison des propriétés de diffusion inhérentes des solutions elles-mêmes, ou si de la poussière ou d’autres solides sont présents. Les filtres sont utilisés pour éliminer cette dispersion résiduelle. Le filtre primaire sélectionne le rayonnement de courte longueur d’onde capable d’exciter l’échantillon d’essai, tandis que le filtre secondaire est normalement un filtre de coupure nette qui permet de transmettre la fluorescence de plus grande longueur d’onde, mais bloque l’excitation diffusée. La plupart des fluorimètres utilisent des tubes photomultiplicateurs comme détecteurs. Le photocourant est amplifié et lu sur un compteur ou un enregistreur.

Spectrofluorimètres à balayage

Quand au moins un monochromateur (réseau ou prisme) est utilisé à la place d’un filtre, l’instrument est appelé un spectrofluorimètre. L’utilisation de réseaux à la place des filtres rend l’instrument supérieur en termes de sélectivité, de flexibilité et de commodité. Les spectrofluorimètres plus complexes utilisent deux réseaux de diffraction (λex) et la longueur d’onde fixe (λf), ainsi qu’une source de xénon de haute intensité, des moteurs de balayage et une compensation électronique pour les variations de l’intensité de la source en tant que longueur d’onde est varié.

Techniques couplées

Lorsqu’un grand nombre d’échantillons doit être analysé rapidement, l’utilisation d’instruments automatiques devient nécessaire. Une voie consiste à utiliser la manipulation automatisée des échantillons dans l’injection de flux technique d’analyse (FIA) .FIA est un exemple de système à flux continu: l’échantillon devient une partie d’un flux dans lequel les opérations unitaires de l’analyse ont lieu lorsque l’échantillon est transporté du point d’injection à un dispositif de mesure de débit. L’intensité du rayonnement qui atteint le détecteur est enregistrée en continu; quand une espèce absorbante traverse le détecteur, un pic net est généré avec la hauteur du pic proportionnelle à la concentration d’analyte. Les tailles d’échantillon sont pour la plupart dans la gamme de 10 à 30 μL.Instruments sont disponibles avec la possibilité d’effectuer des manipulations telles que le chauffage, distillation, extraction, digestion UV en ligne, de sorte que les rayons UV et / ou la spectroscopie visible puisse être utilisée pour une grande variété de composés.

Dans les systèmes multi-composants, la spécificité limitée pour les méthodes spectroscopiques peut être un inconvénient important et une restriction pour l’analyse. Avec la technique de chromatographie liquide, une grande variété de macromolécules et d’espèces ioniques dans des mélanges complexes peut être séparée. Les systèmes de détection dépendent de la nature du composant d’intérêt, cependant, les détecteurs les plus largement utilisés en chromatographie liquide sont basés sur le rayonnement UV ou visible.

Les photomètres utilisent souvent les longueurs d’onde de 254 nm et de 280 nm d’une source de mercure, car de nombreux groupes fonctionnels organiques absorbent dans cette région. Cependant, pour atteindre une spécificité adéquate, on utilise souvent des réseaux de diodes, qui sont capables d’afficher un spectre entier lorsqu’un analyte sort de la colonne [chromatographie liquide avec détecteur à barrette de diodes (HPLC-DAD)]. Comparée à la détection à longueur d’onde unique, qui ne fournit aucune information sur la pureté des pics, la comparaison complète des spectres du réseau de diodes fournit des résultats avec un niveau de confiance beaucoup plus élevé. Généralement, la technique HPLC-DAD est utilisée pour le criblage (screening) toxicologique. Les substances sont identifiées sur la base à la fois du temps de rétention et du spectre UV (Bogusz et Wu 1991, Lambert et al 1995, Tracqui et al 1995, Elliott et Hale 1998). La matrice de diodes peut être également relié à un spectromètre de masse (HPLC-DAD-MS), ce qui augmente la sensibilité et donne une des composantes de confirmation supplémentaire de l’indentité de l’analyte. Le système chromatographique peut être équipé d’un détecteur fluorimétrique (HPLC-FL). Dans le cas de médicaments faiblement fluorescents ou non fluorescents, un certain nombre de réactions de dérivatisation bien caractérisées sont disponibles. Ceux-ci comprennent le chlorure de dansyle (chlorure 5-diméthylaminonaphtalène-1-sulfonyl) pour les amines primaires et secondaires et les groupes hydroxyle phénoliques et la fluorescamine {4-phenylspiro- [furan-2 (3H), 1′-isobenzofuran] -3,3′- dione} et o-phtalaldéhyde pour les amines primaires. Les réactions de dérivatisation de ce type ont étendu le champ de détection de fluorescence en HPLC significatif. Le même type de détecteurs (DAD / fluorescence) peut être couplée à l’électrophorèse capillaire (CE-DAD ou CE-FL) ou par Chromatographie d’ions pour déterminer les composants chargés dans les mélanges complexe.