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Chromatographie, aspects généraux

La chromatographie est une méthode de séparation des constituants présents dans des mélanges variés. Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des composés au sein d’échantillons divers. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles. En chromatographie, l’une, dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première. Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entraînés à des vitesses différentes, provoquant leur séparation. Ce procédé hydrodynamique a donné naissance à une méthode analytique instrumentale qui a un très grand domaine d’applicabilité et par suite se trouve très répandue. Aucun laboratoire analysant des composés moléculaires ne peut ignorer la chromatographie.

La chromatographie analytique

La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation, au même titre que la distillation, la cristallisation ou l’extraction fractionnée, des constituants d’un mélange homogène liquide ou gazeux. Les applications de ce procédé sont donc potentiellement très nombreuses, d’autant plus que beaucoup de mélanges hétérogènes ou sous forme solide peuvent être mis en solution par emploi d’un solvant (celui-ci apparaissant comme un composé supplémentaire). L’expérience de base en chromatographie peut être décrite comme suit (fig. 1.1) :

  1. On immobilise dans une colonne un solide finement divisé appelé phase stationnaire.
  2. On place au sommet de cette colonne un petit volume de l’échantillon à séparer.
  3. On force cet échantillon à traverser la colonne de haut en bas au moyen de la phase mobile afin d’entraîner ses divers constituants.

Si les composés présents migrent à des vitesses différentes, ils pourront être recueillis séparément, chacun en solution dans la phase mobile. En dehors de cette exploitation de la chromatographie qui perdure depuis son origine, ce procédé est devenu en soi une méthode d’analyse lorsqu’on eut l’idée de mesurer les temps de migration des composés dans la colonne pour les identifier. Pour cela il devenait indispensable de maîtriser certains paramètres (débits, température…) et il fallait placer en sortie de colonne un détecteur pour repérer les changements de composition de la phase mobile.

Cette application de la chromatographie, dont le but n’est plus de récupérer les composés séparés mais de mesurer leurs temps de passage dans la colonne s’est développée lentement.

L’expérience de base en chromatographie.
L’expérience de base en chromatographie. a) Les ingrédients nécessaires C, colonne, PS, phase stationnaire, PM, phase mobile et E, échantillon ; b), le dépôt de l’échantillon ; c) le début de l’élution ; d) la récupération des produits après séparation.

L’identification d’un composé par chromatographie correspond à une méthode comparative.

Pour identifier un composé, dont on ne sait s’il s’agit de A ou de B, par la méthode chromatographique, on compare son temps de migration à ceux des deux composés de référence A et B, ceci, sans changer d’appareillage et en se plaçant dans les mêmes conditions expérimentales.

Dans une telle expérience de chromatographie analytique, on n’a pas effectué des séparations (il s’agit de produits purs) mais simplement repéré des temps de migration. Cependant il apparaît trois points faibles à cette méthode : le procédé est assez long de mise en oeuvre, l’identification n’est pas absolue, et le contact physique entre l’échantillon et la phase stationnaire peut modifier ses propriétés à demeure, en particulier les temps de rétention.

Ce procédé particulier de fractionnement est né, sous sa forme moderne, au début du siècle dernier des travaux du botaniste Michaël Tswett à qui on attribue également l’invention des termes de chromatographie et de chromatogramme.

La technique s’est considérablement améliorée depuis ses débuts. On dispose actuellement de chromatographes pilotés par des logiciels qui rassemblent autour d’une colonne performante et miniaturisée – pour pouvoir séparer des micro-quantités d’échantillon – tout un ensemble d’accessoires destinés à assurer la répétabilité des expériences successives par la maîtrise parfaite des différents paramètres de séparation. Pour des analyses successives d’un même échantillon, réalisées dans des conditions identiques à plusieurs heures d’intervalle, les temps de rétention sont reproductibles à la seconde près (fig. 1.2).

Chaque séparation effectuée donne lieu à un enregistrement particulier appelé chromatogramme, qui correspond au tracé des variations de composition de la phase éluée au cours du temps. Pour obtenir ce document particulier, il faut placer à l’extrémité aval de la colonne un capteur dont il existe un grand nombre de variantes.

Principe de l’analyse par chromatographie.
Principe de l’analyse par chromatographie. Le chromatogramme, passage obligé de toute analyse chromatographique, est obtenu à partir des variations en fonction du temps d’un signal électrique envoyé par le détecteur. Il est soit présenté en temps réel soit en différé à partir des valeurs instantanées mises en mémoire dans un micro-ordinateur. Les logiciels de chromatographie recalculent ces valeurs pour être mises au format désiré (a, imprimante). Pendant longtemps il a été obtenu avec un simple enregistreur graphique ou un enregistreur-intégrateur (b). Chromatogramme illustrant la séparation d’un mélange de 3 constituants principaux. Noter l’ordre d’apparition des pics en correspondance avec la position de chaque constituant dans la colonne.

L’identification d’un composé moléculaire, à partir du chromatogramme, est quelquefois aléatoire. Une manière plus sûre consiste à associer deux techniques complémentaires. On réunit, par exemple, un chromatographe et un second appareil « en ligne », tel un spectromètre de masse ou un spectromètre infrarouge. Ces méthodes couplées, du second ordre (ou bidimensionnelles) permettent de récupérer deux types d’informations indépendantes (temps de migration et « spectre »). On peut alors déterminer avec certitude la composition de mélanges complexes ou la concentration de certains composés à partir de quantités de l’ordre du nanogramme (analyses de confirmation).

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