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Techniques Immunologiques – Généralités

Les techniques immunologiques ont une place ferme parmi les méthodes de routine pour l’analyse des médicaments dans les fluides biologiques et d’autres matrices. Chaque technique peut être utilisée par le plus petit ou le plus grand laboratoire avec des méthodes allant des tests de point de soins à usage unique pour l’analyse d’un seul échantillon à des systèmes entièrement automatisés capable d’analyser des milliers d’échantillons par jour. Indépendamment du format, tous les immunodosages sont basés sur l’interaction d’une molécule cible (antigène) avec un anticorps correspondant. Lorsqu’il est appliqué au test médicamenteux, la technique de dosage immunologique utilise un anticorps spécifique pour le médicament ou la classe de médicament à analyser et une forme marquée d’un même médicament ou d’une forme marquée de l’anticorps pour générer un signal mesurable. Le radioimmunodosage ( RIA ) est populaire en raison de sa grande sensibilité, de sa capacité à analyser rapidement un grand nombre d’échantillons et aussi parce que les étapes préliminaires d’extraction ne sont pas requises.

L’immunodosage médicamenteux implique la mise en place d’une compétition pour la liaison à l’anticorps entre l’antigène (médicament) dans l’échantillon et une quantité fixe d’antigène ajouté dans le cadre du système d’essai. Le marquage de cet antigène ou anticorps ajouté avec un marqueur approprié et la mesure du signal généré par une mesure analytique appropriée permettent de comparer les résultats avec une courbe d’étalonnage à partir d’un ensemble de normes avec des quantités connues de médicament ajouté. Alternativement, le résultat d’un échantillon ou d’un ensemble d’échantillons peut être comparé à un calibre de coupure unique pour donner un résultat qualitatif positif ou négatif simple. La technique est capable de haute sensibilité, avec des quantités μg / L facilement détectables et ng / L possible avec des tests spécialisés.

La technique de base consiste à placer une quantité fixe d’un anticorps dans un tube avec une quantité fixe du médicament marqué et l’échantillon d’essai qui contient le médicament à analyser. Les sites de liaison spécifiques sur l’anticorps lient à la fois les molécules de médicament marquées et les molécules de médicament non marquées présentes dans l’échantillon d’essai. La proportion de molécules de médicament marquées liées est inversement proportionnelle au nombre de molécules de médicament non marquées.

Les essais immunologiques sont divisés en deux types selon que, après la réaction de liaison de l’anticorps, il est nécessaire de séparer les fractions liées et libres de l’analyse avant de mesurer le signal: dans les RIA s, la radioactivité est mesurée. Cependant, il n’y a pas de différence entre les signaux produits par un médicament marqué lié et libre, de sorte qu’il est nécessaire de séparer les deux avant la mesure. Ces dosages sont appelés immunodosages hétérogènes. Étant donné que la quantité de médicament radio-marqué qui reste dans la solution, ou est liée à l’anticorps, dépend de la concentration de médicament non marqué, la mesure du médicament radio-marqué dans la forme liée ou libre donne une estimation de l’original concentration de médicament non marqué. Les immunodosages hétérogènes (voir ci-dessous) en utilisant des marqueurs non isotopiques ont largement remplacé RIA , mais dans ce cas, c’est la fraction liée qui est mesurée car un grand excès d’enzyme est présent dans la fraction libre. Avec RIA , on construit une courbe d’étalonnage dans laquelle le pourcentage de médicament marqué lié à l’anticorps est tracé par rapport à la concentration de médicament.

Courbe d'étalonnage verser un dosage immunologique.
Courbe d’étalonnage pour un dosage immunologique.

Pour les analyses dans lesquelles le médicament est marqué avec une enzyme ou une substance fluorescente, la mesure est d’un changement optiquement détecté, tel que l’absorption ultraviolette, la fluorescence ou la luminescence. Dans certains types d’immunodosages optiques, il existe une différence entre les signaux générés par le médicament marqué libre et lié. Ainsi, aucune étape de séparation n’est nécessaire et on les appelle des immunodosages homogènes. La différence entre les signaux peut apparaître car le signal peut être supprimé lors de la liaison, produit lors de la liaison ou modifiée lors de la liaison.

Les immunodosages pour les médicaments peuvent donc être séparés en deux groupes principaux:

  • Les immunoessais homogènes ne nécessitent pas d’antigène lié aux anticorps et l’antigène libre (non lié) doit être séparé avant la mesure du signal.
  • Les immunoessais hétérogènes nécessitent la séparation de l’antigène libre de anticorps et de l’antigène libre avant la mesure du signal.

Les deux types de dosage ont une large application dans le domaine de screening toxicologique, chacun avec ses avantages et ses inconvénients. Des descriptions détaillées de différents types de dosage dans chaque groupe sont données ci-dessous.

Les essais immunologiques offrent une approche souple de l’analyse de divers fluides biologiques pour la présence ou l’absence de médicaments. Ils fournissent une méthode rapide et pratique pour filtrer un grand nombre d’échantillons dans une variété de matrices et permettent la différenciation des échantillons négatifs et éviter ainsi la nécessité d’un traitement, d’une enquête, d’un traitement plus approfondi et coûteux. Lorsque des tests spécifiques sont disponibles, ils peuvent être utilisés pour quantifier précisément et précisément la concentration de médicament dans un échantillon tel que requis pour la surveillance thérapeutique des médicaments ( TDM ) dans un plasma, un sérum ou un échantillon de sang.

Les immunoessais de médicaments ont été utilisés avec succès dans de nombreuses applications de recherche clinique. Moore et al. (1984) ont étudié la pharmacocinétique de la morphine plasmatique après une dose intraveineuse, tandis qu’une série d’immunodosages ont été appliquées à l’étude de la morphine et de ses métabolites par Hand et al. (1987). Plus récemment, Parish et al. (1995) ont utilisé une RIA de cotinine pour établir une relation entre la cotinine et le nombre de cigarettes fumées.

Le dosage immunologique est devenu la méthode de choix de la MDE et les principes et les considérations décrits ici pour l’immunodosage sont applicables à la toxicologie et au dépistage des médicaments. Les principales différences entre ces applications sont le degré de quantification requis ( TDM nécessite des résultats totalement quantifiés) et la sélection d’anticorps avec les profils de réactivité croisée requis. Par exemple, les analyses TDM peuvent nécessiter des anticorps hautement spécifiques qui ne réagissent qu’avec une seule entité chimique, alors que les essais immunologiques utilisés dans la toxicologie ou le dépistage de la toxicomanie peuvent être conçus pour être globalement réactifs avec un groupe de drogues.

Les marqueurs utilisés dans le dosage immunologique comprennent les radio-isotopes, les enzymes, les molécules chimioluminescentes, les particules (comme l’or colloïdal ou les perles de latex) et les molécules fluorescentes. Les formats d’essai immunologique varient en fonction des systèmes conçus pour un test rapide de contrôle d’un échantillon unique grâce à des systèmes entièrement automatisés pouvant traiter des milliers d’échantillons par jour.

La première méthode RIA , publiée par Yalow et Berson (1959), était destinée à l’analyse de l’insuline. Cela a annoncé le début d’un champ d’analyse qui est maintenant utilisé de manière routinière dans les disciplines de la chimie clinique, de l’endocrinologie, de la pharmacologie et de la toxicologie. Les anticorps dirigés contre la morphine par Spector et Parker (1970) ont été utilisés dans le développement d’un dosage immunologique utilisant un traceur radioactif ( RIA ) et de nombreuses variantes ont suivi depuis. Du point de vue de l’utilisateur final, la grande majorité des immunodosages utilisés aujourd’hui sont sous la forme de tests commerciaux exclusifs, faciles à utiliser, automatisés, semi automatisés ou simples. Cependant, l’immunochimie utilisée pour produire ces kits de test implique de nombreuses interactions complexes de produits biochimiques avec l’échantillon testé. Les articles qui suivent (AnalyticalToxicology.com) décrivent les principes de l’immunodosage car ils concernent spécifiquement les tests qualitatifs de drogues et traite des principaux types d’immunodosage dans l’usage courant.

Traduit en Français par : BENSAKHRIA Ayoub (source: Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons 3rd Edition)

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