Screening toxicologique par HPLC DAD

En toxicologie clinique et médico-légale, le screening toxicologique permet de détecter et identifier les composés exogènes présents dans le sang et les urines. Cet article décrit les applications d’un système de dépistage des drogues HPLC-DAD basé sur les indices de rétention et les spectres UV.

Un système d’élution HPLC à gradient est utilisé pour le screening toxicologique général. L’utilisation d’un détecteur à barrette de diodes (DAD) avec un logiciel d’analyse de chromatogramme et une bibliothèque numérique permet le stockage des paramètres de rétention, des spectres UV et des paramètres de qualité optimaux pour chaque substance examinée. La bibliothèque développée est utilisée pour l’identification automatique des composés. Les indices de rétention de 225 substances sont mesurés sur l’échelle 1-nitroalcane. Ces données peuvent être utilisées de façon inter-laboratoire en raison d’une procédure de correction appropriée. Les reproductibilités à long terme du comportement de rétention des 1-nitroalcanes et des normes de correction sont satisfaisantes. Les conditions d’utilisation interlaboratoires sont discutées.

Source : Bogusz M1, Wu M. Standardized HPLC/DAD system, based on retention indices and spectral library, applicable for systematic toxicological screening. July 1991. Journal of analytical toxicology 15(4):188-97

Introduction

Il existe un certain nombre de techniques chromatographiques établies disponibles pour les toxicologues, telles que la Chromatographie sur couche mince (CCM), la Chromatographie en phase gazeuse (CG) et la Chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP). En outre, coupler la CG et l’HPLC avec un spectromètre de masse (MS) améliore l’efficacité de ces techniques pour le dépistage toxicologique général des médicaments. Des bases de données chromatographiques analytiques de médicaments importants sur le plan toxicologique ont été produites pour la CCM et la CG, et des tentatives ont été faites pour produire des bases de données similaires pour HPLC.

L’HPLC a été utilisé pendant longtemps comme méthode complémentaire à la GC parce qu’elle peut séparer une plus large gamme de composés sans avoir besoin d’étapes de dérivatisation de certains médicaments et métabolites fortement polaires et thermolabiles.

Le système décrit ici utilise HPLC en phase inverse (RPHPLC) qui est devenue la méthode de séparation la plus courante. Il existe différentes colonnes RPHPLC disponibles basées sur différents matériaux d’emballage fournissant différentes sélectivités. Les colonnes d’octadécylsilane (ODS) sont probablement le type le plus commun dans l’utilisation de routine; Cependant, nous avons utilisé des colonnes modifiées à la fois avec de la silice octadécyl et cyanopropyl (OD / CN), qui se sont révélées offrir un avantage de sélectivité par rapport à ODS. Comme le matériau d’emballage de la colonne n’est pas du type activable, un modificateur aminé (triéthylammonium) est utilisé pour favoriser une élution optimale des composés basiques.

Les détecteurs ultraviolets à diodes (DAD) enregistrent l’absorbance des composés sur une gamme de longueurs d’onde allant de 200-595 nm. Lorsqu’ils traversent la cellule d’écoulement du détecteur, permettant ainsi l’acquisition en ligne des spectres ultraviolets (UV). L’HPLC DAD est un outil très important dans l’identification des composés; cependant, comme certaines classes de médicaments (par exemple les barbituriques) peuvent présenter des spectres UV similaires, il est souhaitable d’avoir un second paramètre d’identification, tel qu’un indice de rétention ou un temps de rétention relatif. Il est inhabituel pour une substance d’avoir un temps de rétention absolu qui reste constant soit sur une période de temps (en raison d’une perte progressive de la phase stationnaire) soit entre différents lots de colonnes avec un matériau d’emballage nominalement identique.

Afin de tenir compte de cette variabilité, l’indice de rétention (IR) peut être utilisé comme méthode de correction. Les IR sont basés sur la relation entre le temps de rétention d’une substance et ceux d’un certain nombre de composés de référence (marqueurs). Les temps de rétention des autres substances sont convertis en valeurs RI par interpolation linéaire entre les composés de référence. La plupart des méthodes de GC standardisées utilisent des valeurs de RI basées sur les temps de rétention d’une série homologue d’hydrocarbures. Les systèmes de CLHP à base d’IR ont utilisé des hydrocarbures, des marqueurs de médicament unique et, récemment, des 1-nitroalcanes. Pour ce système, un certain nombre de médicaments acides / neutres et basiques qui ont été élués à intervalles réguliers ont été utilisés comme marqueurs de rétention, fournissant des échelles d’IR distinctes pour les médicaments acides / neutres et basiques; cela s’est avéré avantageux dans une enquête précédente. Des systèmes de criblage HPLC fournissant de grandes bases de données de médicaments ont été publiés, tels que Bogusz et al. système et le système automatisé REMEDi commercialisé par Bio-Rad.

Figure: Résultats d’un screening toxicologique urinaire utilisant du HCl 1N comme tampon et de l’acétate d’éthyle comme solvant d’extraction. Un gradient d’élution de 4 à 70% d’acétonitrile sur 15 min a été utilisé pour éliminer les perturbations de base. Le chlorothiazide diurétique a été détecté par comparaison des spectres UV et des valeurs de RI.

Méthode

Equipement

Une pompe M480 de haute précision, four à colonne, Gina 500 autosaropler, et un détecteur à barrettes de diode DAD UVD340S, tous deGynkotek (technologies HPLC, Macclesfield, Cheshire, Royaume-Uni), et un X-Act à quatre canaux dégazeurs de Jour Research. Quatre Colonnes à cartouche de 50 x 50 po / CN 50 D / CN Spherisorb (Phase Sep Ltd., Royaume-Uni), protégé par 4 x 10-ram.

Des colonnes de garde de Spherisorb S5ODS2 ont été utilisées pour l’étude. La colonne de saturation n’a pas été utilisée.

L’acquisition des données a été gérée par un logiciel Gynkosoft. Les données spectrales d’enregistrement DAD ont été faites entre 200 nm et 595 nm.

Le système GC était un Ai GC 94 (Ai Cambridge Ltd., Cambridge, U.K.) équipé d’un détecteur spécifique au phosphore (NPD) et une flamme détecteur d’ionisation (FID). Le GC a été équipé de un échantillonneur automatique CTC Analytics A200SE (Zwingen, Suisse). La colonne était une HP5 25-m x Colonne capillaire 0,32-ram avec une phase DB5, l’Épaisseur de film est de 0,52-pro (Hewlett-Packard, Brack-nell, Royaume-Uni).

Matériel et réactifs

• Tampon phosphate de triéthylammonium 1,0M (pH 3,0)
• Acétonitrile de qualité HPLC
• Méthanol de qualité HPLC
• Étalons :  benzophénones produits par hydrolyse acide d’une solution méthanolique de benzodiazépine avec du
  HCl concentré suivie d’une évaporation à sec et une reconstitution avec du méthanol de qualité HPLC.
• Un mélange de chacun des médicaments de référence à une concentration de 0,1 mg / mL en  méthanol qualité HPLC, sauf pour l’éphédrine qui était de 0,25 mg / mL.
• Le volume d’injection est de 10 µL. Pour cela Les différents médicaments de référence ont été dissous en méthanol  HPLC à une concentration de 1 mg / mL et dilué avant injection à une concentration finale de 0,1 mg / mL avec du méthanol.

Méthodes d’extraction pour les échantillons biologiques

Le sang total, le sérum, le plasma et les urines prélevés sont extrait à l’aide de techniques d’extraction liquide-liquide internes associées aux systèmes GC et HPLC.

Pour les médicaments basiques:

• 200 μL de tampon Na2CO3 0.2M sont ajoutés à 500 µL d’échantillon suivi de 5 ml de 1-chlorobutane.
• Agiter pendant 3 minutes
• Centrifuger à 2700 tr / min pendant 3 minutes, transférer le surnageant dans un second tube,
• Ajouter 100 µL 0,05 M H2SO4.
• Transférer 20 µL de la couche d’acide dans un Ependorff pour l’injection.

Pour les médicaments acides / neutres:

• 500 μL de H2SO4 à 500 μL de échantillon avec 5 ml de chloroforme ajouté comme solvant d’extraction
• Agiter pendant 3 minutes
• Centrifuger à 2700 tr / min pendant 3 minutes,
• filtrer à travers un filtre en papier saturé par le chloroforme,  évaporer à sec et reconstituer avec 100 ul de méthanol avant l’injection.
• injecter 20 µL.

Méthode d’analyse par HPLC-DAD

On réalise une élution à gradient en une seule étape en utilisant une phase mobile mixte.

Phase mobile A contient :

700 ml d’acétonitrile de qualité HPLC à 99,9% + 25 mL de tampon phosphate de triéthylammonium 1M
(pH 3,0) dilué avec 275 ml d’eau distillée de qualité HPLC, jusqu’à une concentration finale de tampon de 25 mM et 70% d’acétonitrile. Le pH du mélange résultant n’a pas été ajusté, et le pH résultant, tel que mesuré par
un pH-mètre, était de 4,0.

La phase mobile B consistait en:

25 ml de tampon phosphate de triéthylammonium 1M dilué avec 975 ml d’eau de qualité HPLC jusqu’à la finale
concentration de tampon 25 mM. Le pH du mélange n’a pas été ajusté et était donc 3,0.

Conditions d’élution

Un  débit de 2 ml / min de 0-70% acétonitrile sur 25 mn et maintenu à 70% en acétonitrile pendant 5 min. Il a été constaté que le temps d’équilibre était nécessaire à cause des perturbations de la ligne de base dans le cycle suivant.

Pour cela, l’éluant a été maintenu à 70% d’acétonitrile pendant 5 minutes supplémentaires, puis réduit de 70 à 0% acétonitrile sur 5 mn, et finalement détenu à 100% de tampon (phase mobile B) pendant 5 min. Cela a donné une durée totale de 45 min entre les injections, avec l’acquisition de données pendant les 30 premières minutes le température de la colonne a été maintenue à 25 °C

Les conditions d’élution pour le gradient rapide ont été obtenues en utilisant un débit de 2 mL/min de 0-70% d’acétonitrile plus de 15 mn et maintenu à 70% d’acétonitrile pour 3 mn. Pour l’équilibre, l’élution a été immédiatement maintenue à 100% de tampon (phase mobile B) pour 4 mn. Cela a donné une durée totale de 22 mn entre les injections, avec l’acquisition de données au cours des premières 18 mn. La température de la colonne était maintenue à 25 °C.

Calculs des indices de rétention

En HPLC, CG, l’indice de rétention de Kovats (en abrégé indice de Kovats ou simplement indice de rétention) est utilisé pour convertir les temps de rétention en constantes indépendantes du système.

Intérêt

L’indice de rétention d’un composé chimique est son temps de rétention normalisé par le temps de rétention de l’éluant des n-alcanes adjacents. Alors que le temps de rétention varie avec les différents systèmes de chromatographie (par exemple en ce qui concerne la longueur de la colonne, son diamètre, l’épaisseur du film, la vitesse du gaz porteur ou encore la pression), les indices de rétention calculés sont assez indépendants de ces paramètres et permettent de comparer des valeurs de mesures prises par différents laboratoires d’analyse sous différentes conditions.

Un mélange contenant 5 médicaments acide / neutre et 5 médicaments basiques:

Ce tableau fournit une échelle d’index de rétention arbitraire mais qui reste linéaire pendant le gradient d’élution.

Calculs des indices de rétention relative

On repère position de la substance en question entre deux marqueurs (selon sa nature : pour les médicaments acides et neutres par interpolation entre les étalons de médicaments acides et pour les médicaments basiques par interpolation entre les médicaments basiques).

Les valeurs d’indice de rétention ont été calculées en utilisant la formule suivante :

où t _R est le temps de rétention du toxique (min), t₁ est le temps de rétention du premier marqueur (min), t₂ est le temps de rétention du deuxième marqueur (min), et RI₁ est la valeur RI du premier marqueur.

Les valeurs RI pour les substances éluées à l’extérieur des plages de rétention des marqueurs de référence ont été calculées comme suit. Pour les substances éluant avant le marqueur I (c’est-à-dire 100 unités RI) :

où t_R est le temps de rétention du toxique (min) et T₁ est le temps de rétention de Marqueur 1 (par exemple, éphédrine ou paracétamol) (mn).

Pour les substances éluant après le marqueur 5 (c.-à-d. 500 unités RI) :

où t_R est le temps de rétention du toxique (mn) et T₅ est le temps de rétention du Marqueur 5 (par exemple, l’amiodarone ou le lorazépam benzophénone) (min).

Les spectres UV et les valeurs RI de plus de 250 substances chimiques ont été acquises sur la base des gradients étendus et compilés pour construire une base de données de RI et de Spectres UV.

Développement d’une technique de screening relativement rapide

La rampe d’élution à gradient de 0-70% d’acétonitrile en 25 min a été choisie à l’origine car elle permettait une résolution optimale des médicaments à élution rapprochée, mais les résultats ne pouvaient être analysés avant l’acquisition des données (après 30 mn). C’est un temps d’attente acceptable pour un travail d’analyse clinique et médico-légal de routine pendant la journée. Cependant, pour le dépistage d’urgence des médicaments, il a été décidé d’essayer de développer une méthode de screening  rapide pour l’analyse HPLC-DAD qui permettrait une acquisition rapide de les résultats et donc (dans le cas de la toxicologie clinique) améliorent la prise en charge du patient car le traitement de soutien correct ou antidotal pourrait être ainsi administré plus rapidement avec une identification plus rapide des médicaments impliqués.

Etude des gradients

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Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

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