Evaluation de la fonction mitochondriale

Les mitochondries exercent deux fonctions essentielles dans la cellule, à savoir la production de 90% de l’énergie de la cellule, et le contrôle de la survie cellulaire en tant que partie de la mort cellulaire programmée (apoptose). Les changements indésirables dans l’une ou l’autre de ces fonctions peuvent avoir des conséquences désastreuses, et donc la surveillance des composés pour la toxicité mitochondriale est un élément crucial de tout programme de dépistage toxicologiques, et de nombreux études toxicologiques.

Chaque année, un pourcentage appréciable de drogues est retiré du marché, ou leur utilisation est réduite suite à des avertissements relatifs au danger qu’elles représentent à des doses élevées, ou en raison d’un effet négatif qui n’a pas été encore découvert pendant les essais précliniques et cliniques. C’est souvent parce que l’effet indésirable est subtil et ne conduit pas à l’histopathologie.

Récemment, et avec une meilleure compréhension de la structure et de la fonction mitochondriale, des tests de dysfonctionnement mitochondrial ont été développés. L’Application de ces tests a révélé une forte détérioration mitochondriale par plusieurs médicaments précédemment retirés y compris la cérivastatine (Baycol), la troglitazone (Rezulin), la néfazodone (Serzone) et Tolcapone. Il n’est donc pas surprenant que l’accent soit mis sur l’identification de la toxicité mitochondriale au début du processus de développement.

Il ya trois effets indésirables généraux qui résultent de la toxicité mitochondriale: 1. perturbation du métabolisme énergétique; 2. augmentation de la génération de radicaux libres; 3. apoptose.

La capacité et les connaissance pour tester les médicaments pour ces effets progressent rapidement. Pendant plusieurs années,  les systèmes de dépistage cellulaire tels que Cellomics® ont été disponible et comprennent typiquement un ou plusieurs essais de toxicité mitochondriale, tels que des dosages pour évaluer la production d’ATP, le potentiel membranaire, l’activation de la caspase 3 (apoptose) et les espèces réactives de l’oxygène. Ces analyses présentent un écran de premier ordre utile pour les analyses mitochondriales générales.

Mais aucun de ces dosages ne peut, même en combinaison, fournir les données mécanistiques sur laquelle des décisions oui / non peuvent être prises en toute confiance quant à la sécurité d’un médicament. Ces dosages sont également les plus appropriés pour identifier les effets toxiques aigus et les effets chroniques de l’expression des protéines mitochondriales et les effets des modifications post-traduction qui peuvent être manquées.

L’ensemble de tests de la toxicité mitochondriale étend la capacité de collecte de données du toxicologue en permettant d’identifier et de mesurer des sites spécifiques et des mécanismes de toxicité au niveau de chaque protéine.

Paradigme de test de toxicité mitochondriale. Les trois effets toxiques généraux peuvent être mesurés en utilisant des dosages appropriés à la fois pour le criblage ainsi que pour ceux convenant au mécanisme d’action pour des études détaillées. Tous les dosages peuvent être réalisés dans des plaques à 96 puits. Tous les essais de dépistages ainsi que les autres essais de biogénèse mitochondriale sont disponibles chez divers fournisseurs, Le dosage de la biogénèse ainsi que le reste des essais mécanistiques sont exclusifs à « Mitosciences » « le kit ».

Dépistage général de la fonction mitochondriale

Les analyses utilisées pour le criblage initial sont typiquement effectuées sur des cultures cellulaires dans les 6 à 24 heures suivant l’administration du médicament pour identifier les effets aigus. Les analyses de ce panel comprennent:

A. Production d’ATP

La réduction de la production d’ATP peut être primaire causée par un trouble Mitochondrial, ou secondaire due à la modification du métabolisme par l’intermédiaire des interactions des composés cellualaires.

B. Potentiel Membrane Mitochondrial

La mesure du potentiel de membrane fournit des informations sur la capacité de couplage du transfert d’électrons à la synthèse de l’ATP, ainsi que la capacité de l’organelle à prendre et à libérer des ions et des substrats à travers la membrane interne mitochondriale.

C. Consommation d’oxygène

La mesure de la consommation d’oxygène complète les dosages de l’ATP et du potentiel de membrane, puisque l’utilisation de O₂ par la cellule est en fonction à la fois du débit du couplage de la chaîne de transport d’électrons et le processus de la production d’ATP. De plus, le taux de consommation de O₂ est directement lié au potentiel de la membrane car le découplage, et la perte résultante de la translocation de protons à travers la membrane interne mitochondriale, entraînent une perte de potentiel de membrane. La détermination de la consommation d’O₂ est la meilleure façon pour identifier les composés qui agissent comme désaccoupleurs et qui sont souvent, mais pas toujours, faiblement hydrophobes.

D. Production de radicaux libres et le Glutathion

L’augmentation de la production de radicaux libres est caractéristique de la dysfonction mitochondriale qui peut être
Mesurée à la fois par des dosages à base de colorants basés sur la génération de superoxyde ainsi que la réduction des taux de glutathion. La source prédominante de la génération de radicaux libres est la la chaîne respiratoire mitochondriale, et l’inhibition de ce processus est souvent liée à des niveaux accrus de radicaux libres. Cependant, il existe d’autres sources cellulaires de radicaux libres dans des cellules, et ceci n’est donc pas un indicateur sans équivoque de k’effet direct du composé sur le organelle. De plus, le dosage standard des capteurs de radicaux libres ne mesure pas les conséquences de de l’augmentation chroniques de la génération de radicaux libres.

E. Activation Caspase 3 & PARP

L’induction de l’apoptose est une mesure critique à effectuer, et plusieurs paramètres différents de ce processus sont souvent déterminés dans des contexte de forte teneur, y compris des la distribution de la phosphatidylsérine par la membrane plasmatique et l’activation des caspases.

La dysfonction mitochondriale peut induire l’apoptose, et il existe un lien entre la perte en production d’ATP et l’apoptose qui semble corréler avec la production de radicaux libres.

L’apoptose peut également être déclenchée par de nombreux événements cellulaires qui n’impliquent pas directement le dysfonctionnement des mitochondries y compris les lésions chromosomiques, mais inévitablement l’organite devient le foyer de ces réactions.

F. Biogenèse mitochondriale

Un composé qui ne présente pas d’effets toxiques dans les essais de criblage susmentionnés, même à des concentrations élevées, ne peut être considéré comme exempt de toxicité mitochondriale jusqu’à ce que le potentiel de toxicité chronique sera évalué. Cela nécessite la culture des cellules avec ce composé pendant aussi longtemps qu’une semaine, ou jusqu’à ce qu’il y ait eu plusieurs divisions cellulaires. C’est particulièrement important pour les antibactériens et les antiviraux, qui peuvent affecter la biogenèse mitochondriale.

La figure 3A montre une inhibition maximale de la Biogenèse mitochondriale après de multiples divisions cellulaires par certains anti-bactériens et anti-viraux, alors que la figure 3B montre la perte de protéines mitochondriales induite par L’antibiotique choramphénicol, en fonction du dosage. Le test de biogenèse mitochondriale est disponible en format de 96 puits (MS641) utile pour des expériences cellulaires et (MS631) utile pour les études sur les animaux et les essais cliniques.

Etant donné que la réplication mitochondriale et la plus proches de celle chez les bactéries par rapport aux systèmes cytosoliques / nucléaires correspondants. Ainsi, toute évaluation de la toxicité de substance antibactériennes ou antivirale destinée à attaquer les polymérases bactériennes ou leurs machines de synthèse doit être évalués pour leur effet sur les mitochondries.

L’évaluation de la biogenèse mitochondriale mesure quantitativement la quantité d’une enzyme dont la présence dépend de la réplication mitochondriale et de la synthèse des protéines (cytochrome C oxydase) avec celle d’une protéine mitochondriale codée par l’ADN nucléaire et traduite dans le cytosol (frataxine).

Exploration du mécanisme d’action

A. Essais sur l’activité enzymatique OXPHOS

Ces essais ont pour but de mesurer l’effet direct des médicaments sur les principales enzymes de la chaîne respiratoire. De nombreux médicaments sont des inhibiteurs d’un ou plusieurs de ces complexes, et une telle interaction peut être une cause primaire de toxicité cellulaire si le composé est susceptible de pénétrer dans les mitochondries. En fait, une partie significative de ces composés, et en particulier ceux qui sont des acide faibles hydrophobes, peuvent se concentrer dans les mitochondries.

Table : Sélection de composés avec effets inhibiteurs sur les complexes de la chaîne respiratoire. Les données sont normalisées en pourcentages d’activité enzymatique. OX1 L’activité du Complexe I, OX2 + 3 mesure la Activité des complexes II et III, l’OX4 mesure Activité du Complexe IV, et OX5 mesure la Activité de l’ATP synthase.

Relation dose – réponse (effet) de l’activité de l’ATP Synthase (Complexe V) et le succinate Ubiquinone oxydoréductase (Complexe II) en présence de Troglitazone et Simvastatine respectivement. L’activité est affichée Sur l’axe X et est donné en pourcentage du contrôle DMSO. La concentration de composés est représenté sur l’axe Y et est donnée en µM.

B. Essais de Fractionnement et cellulaire et translocation de protéines apoptotiques

Pour mesurer les mouvements de protéines entre les compartiments cellulaires à la suite d’un traitement médicamenteux. La délocalisation des protéines est une partie importante de la signalisation cellulaire métabolique et une étape irréversible de l’apoptose. La libération du cytochrome c et d’autres facteurs apoptotiques de la mitochondrie est le point irréversible dans le processus apoptotique. En outre, il y a apparition de nouveaux facteurs de transcription entre les facteurs mitochondriaux et les compartiments cellulaires. De tels mouvements sont des étapes clés dans le contrôle de la biogenèse et la fonction mitochondriale ainsi que dans l’exécution de l’apoptose.

Le mouvement des protéines dans et hors des mitochondries dans l’apoptose.

Cette figure Montre certains des mouvements clés des facteurs apoptotiques pendant la mort programmée de la cellule. Le suivi de ceux-ci fournit un aperçu de la nature et du site de la signalisation apoptotique, et donc le mode d’action d’une substance sur la machine apoptotique.

Séparation des fractions HepG2 cytosoliques (C), Mitochondriales (M) et nucléaires (N), le Kit Mitosciences utilisé pour la séparation (MSA861). Les Fractions Ont été analysés par Western blot en utilisant des Anticorps Anti- matqueurs cytosoliques (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, GAPDH), Mitochondriaux (Hsp70, F 1 -ATPase α, Pyruvate Déshydrogénase (PDH) E1α et le cytochrome C), et nucléaires (PARP et SP1).

Lorsque des cellules subissant une apoptose sont examinées de la même manière, toute redistribution des protéines peuvent être détectées et quantifiées. La figure (ci-dessus) montre l’exemple d’apoptose induite Par le Gleevec dans les cardiomyocytes. En plus de la libération de cytochrome c et SMAC Diablo (Non représenté pour simplifier), il existe un déplacement important de Bax, l’activation (clivage) et redistribution de PARP et le mouvement de GAPDH à partir d’une forme soluble dans le cytosol.

Avec différents stimulus apoptotiques, l’implication et les mouvements des protéines Bid, p53, PUMA etc peuvent être suivis en utilisant des mixtures mAb appropriées.

C. Expression de protéine et essais de modification post-traductionnelle

Pour mesurer les niveaux de protéines métaboliques, les antioxydantes et les pro et anti-apoptotiques, ainsi que leur phosphorylation, leur acétylation et leurs modifications (Oxydation/ Nitration).

Les cellules sont le siège des mécanismes aigus et à long terme d’adaptation aux stress. Les changements aigus sont basés sur la régulation du métabolisme par des modifications post-translationnelles telles que la phosphorylation / déphosphorylation et Acétylation / désactylation. L’adaptation à long terme est basée sur des changements dans la structure de la protéine elle-même.

La puce MetabArray ™, par exemple fournie par Mitosciences contient des Anticorps qui fixent plus de 50 protéines clés métaboliques, antioxydantes et apoptotiques, ces protéines cibles qui ont été sélectionnées en fonction de leur évolution en fonction des traitements médicamenteux ou sur des rapports mentionnés dans la littérature concerant à leur up- ou down-regulation pendant le stress cellulaire.

Lorsque les cellules sont comparées avant et après un traitement médicamenteux, des modifications d’une large gamme d’enzymes peut donc être analysée qualitativement pour identifier les changement métaboliques induits. De nouveaux mAbs sont ajoutés régulièrement à ce tableau.

Quantification de la modification de nitrotyrosine, représentée comme Signal à l’arrière-plan, après que les mitochondries sont exposées in vitro au Peroxynitrite (800 uM). De nombreuses enzymes sont modifiées vraisemblablement en fonction des résidus de tyrosine accessibles en surface.

Avec la mesure de l’expression des protéines, le MetAbArray ™ peut être duplexé pour la meure des activité de phosphorylation et d’acétylation.

Le MetAbArray ™ peut également être duplexé Avec des mesures des dommages oxydatifs. Le kit peut ainsi donner un aperçu des en mesurant non seulement la régulation ascendante ou descendante des principaux éliminateurs de radicaux libres comme la SOD1, la SOD2 et la catalase.

Les effets du stress oxydatif sur l’enzyme pyruvate déshydrogénase (PDH), le principal régulateur du Métabolisme oxydatif, sont étudiés plus en détail. (A) Comme la nitration des tyrosines augmente avec exposition aux conditions oxydantes, l’activité diminue en raison des modifications. (B) Après purification en utilisant une technnique d’immunocapture le site de modification est clairement la sous-unité E2 qui contient une fonction Lipoyle fonctionnellement nécessaire. L’acide lipoïque acide très lié.