vitamine D3

La vitamine D est une substance chimique  liposoluble qui joue un rôle biologique très important chez l’homme, elle est aussi essentielle dans l’alimentation animale. Elle existe sous deux formes “viz”, à savoir la vitamine D2 et D3.

Structure du Cholecalciferol (D3)
Structure du Cholecalciferol (D3)

La Vitamine D3  (Cholécalciférol) est synthétisée de façon endogène à partir du 7-déshydrocholestérol après irradiation ultraviolette, elle peut être absorbée aussi à partir des sources alimentaires; l’Ergocalciférol dérivé de plantes / levures (vitamine D2) ) est  formé depuis une source exogène par irradiation de l’ergostérol.

La vitamine D joue un rôle important dans le maintien du taux De calcium et de phosphore dans la circulation sanguine et c’est un élément essentiel pour le bon développement et le maintien de l’os [1] Weaver CM, Fleet JC (2004) Vitamin D requirements: current and future. Am ...continue. Des preuves scientifiques
ont révélé que cette vitamine n’était pas seulement associée à des troubles squelettiques mais jouait également un rôle important dans le cancer, les maladies cardiovasculaires, les maladies auto-immunes, l’hypertension, le diabète sucré, etc. [2]Lappe JM, Travers-Gustafson D, Davies KM, Recker RR, Heaney RP (2007) Vitamin ...continue [3]Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Garland FC (2009) Vitamin D for ...continue [4]Stechschulte SA, Kirsner RS, Federman DG (2009) Vitamin D: bone and beyond, ...continue

La vitamine D n’est pas une seule molécule mais une famille de composés qui présentent l’activité de la Vit D. Sa mesure est importante en tant qu’indicateur de carence nutritionnelle en vitamine D, qui est l’une des principales causes de l’ostéoporose.

Les analystes des laboratoires cliniques ont une sélection diversifiée de méthodes de dosage de la Vit D. Les méthodes de routine permettent la mesure de la concentration de la vitamine D3 dans le plasma humain basées sur les liaisons compétitives aux protéines, et la protéine de liaison à la vitamine D utilisée et un traceur marqué au tritium. Ces méthodes ont été remplacées par une méthode plus simple, la RIA rapide et un traceur radio iodé a été incorporé dans la RIA En 1993 . Les dosages quantitatifs par HPLC ont été développés avec détection ultraviolette et la séparation en phase inverse. Récemment, des méthodes de RP-HPLC pour la quantification de la vitamine D3 dans le plasma humain ont été développées [5] Wallace AM, Gibson S, de la Hunty A, Lamberg-Allardt C, Ashwell M ...continue.

En revanche, dans d’autres domaines de recherche comme l’alimentaire, Le défit majeur dans l’étude clinique est la limitation de la taille de l’échantillon. En dépit de ça, la plupart des méthodes disponibles pour l’estimation de la vitamine D3 ont été développées sur LC-MS / MS, ce qui a augmenté le coût par analyse d’échantillon. Par conséquent, une approche simple, sensible et économique est la solution idéale : La Méthode du dosage par RP-HPLC de la vitamine D3.

Nous avons développé et décrit ici une étude comparative entre deux méthodes de mesure de la vitamine D 3 par HPLC. La présente étude a été conçue pour rendre le processus d’estimation de la vitamine D facile à utiliser, sensible, rapide et économique à l’échelle du laboratoire.

Matériel et méthodes

Appareil

Le système CLHP utilisé tout au long de cette étude est composé d’une pompe Quaternaire (Ultimate 3000, Thermo Fischer Scientific, Etats-Unis), Un injecteur d’échantillon manuel avec une boucle d’injection de 20 μl, un dégazeur
Et une photodiode (Thermo Fischer Scientific, USA).

L’évaluation et la quantification des signaux de sortie ont été faite par un Logiciel Chromelion version 6.80 qui contrôle l’ensemble du système chromatographique. La colonne utilisée est une phase inversée, Acclaim TM 300, colonne C18 (150 x 4,6 mm i.d., 3μm de taille de particule, 300  Diamètre), obtenue auprès de Thermo Fischer Scientific, USA. Deux Des phases mobiles ont été utilisées dans l’étude, l’acétonitrile (pH 5,19) /Méthanol (pH 4,7) (95: 5%) et du methanol avec 0,1% d’acide formique (pH 3,0) / eau avec 0,1% d’acide formique (pH 2,83) (95: 5%) respectivement. Les échantillons ont été passés à un débit de 0,4 mL / min de la phase mobile avec une fenêtre de temps d’analyse de 10 min. La température de la colonne a été maintenue constante à 40ºC. Les résultats ont été observés à une longueur d’onde de 265 nm pour la vitamine D3.

Matériel

Les produits chimiques et les solvants utilisés tout au long de cette analyse tels le méthanol (Sigma Aldrich, Suède) et d’acétonitrile (Sigma Aldrich, Suède) étaient de qualité élevée et de grade HPLC. L’étalon de la Vit.D 3 était obtenue auprès de Sigma Aldrich, Suède.

Préparation

La solution stock de l’étalon de la vit.D3 (1 mg ML / 1) est préparée dans du methanol et stocké à -20 ° C. Une solution fille est ensuit préparée en diluant la solution mère dans l’acétonitrile.

Extraction de la vitamine D

L’extraction de la vitamine D a été effectuée suivant une Méthode légèrement modifiée de Turpeinen et al. [6]Turpeinen U, Hohenthal U, Stenman UH (2003) Determination of 25-hydroxyvitamin ...continue. Pour 0,5 ml d’échantillon / matrice, nous avons ajouté 350 μl de méthanol et 2-propanol à un rapport de 80:20 (v / v). Le contenu a été mélangé dans un mélangeur Vortex pendant 30 s. La vitamine D a été extraite en mélangeant deux fois (60 s à chaque fois) avec 1 ml d’hexane. Les phases ont été séparées par centrifugation et la phase organique supérieure a été transvasée dans un tube conique et séchée sous azote. Le résidu était dissous dans un volume approprié de phase mobile.

Linéarité

Une solution mère de 1 mg / ml de Vit D 3 a été préparée en dissolvant 1 mg Vit D 3 lyophilisée dans 1 ml de méthanol puis des solutions de différentes concentrations (0,5-5 ng / mL) pour la construction de la gamme d’étalonnage. La phase mobile était filtrée à travers un filtre à membrane de 0,45 μm et passé à travers la colonne à un débit de 0,4 ml / min pour l’équilibrage des colonnes; La ligne de base a été surveillée continuellement pendant ce processus. La détection a été effectuée à λ max  de 265 nm. Les dilutions préparées ont été injectées en série, la surface du pic a été calculée pour chaque dilution (intégration), et la concentration a été représentée en fonction de la surface sous le pic.

Exactitude

L’exactitude a été déterminée par la méthode d’addition standard. La matrice (1x PBS + 0.1% BSA, pH 7.2) a été additionné de 3,5 et 15 ng / mL et les mélanges ont été analysés par la méthode proposée. L’expérience a été effectuée en triple. Récupération (%), DSR (%), et l’erreur type (SE) a été calculée pour chaque concentration.

Précision

La précision a été déterminée ainsi que la répétabilité et la précision intermédiaire, conformément aux recommandations de l’ICH. La répétabilité de l’injection d’échantillon a été déterminée en fonction de la variation intra-jour. La précision intermédiaire a été déterminée par la mesure des variations inter-jours. Pour l’étude des variations intra et inter-jours, nous avons choisi des étalons entre 0,5 et 2 ng / mL -1 et 0,5-5 ng / mL  de Vit D3, respectivement.

Limite de détection (LOD) et Limite de quantification (LOQ)

LOD et LOQ ont été déterminés par la méthode de l’écart-type (σ). LOD et LOQ ont été déterminées à partir de la pente, S y/x par la formule :

LOD = 3 × σ/S et
LOQ = 10 × σ/S.
σ = l’écart-type, S = la pente.

Efficacité

L’efficacité a été calculée en utilisant la formule suivante:

(N = Efficacité, t R = Temps de rétention, W b = Largeur du pic)

 

Robustesse

La robustesse de la méthode a été déterminée pour évaluer l’effet d’une variation minime mais délibérée des conditions chromatographiques de l’analyte et a été déterminée en modifiant le débit et concentration de la phase mobile jusqu’à 1%.

Résultat et discussion

Dans la présente étude, nous avons développé une méthode HPLC pour la détection fiable de la vitamine D 3 en utilisant deux phases mobiles différents suivant les recommandation de l’ICH.

Chromatogramme d'un étalon Vitamine D3
Chromatogramme d’un étalon Vitamine D3 utilisant une phase mobile (Acétonitrile: Méthanol (95: 5 v / v) (Méthode I) et (B) Méthanol: Eau Avec de l’acide formique à 0,1% (95: 5 v / v) (Méthode II).
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Références   [ + ]

1. Weaver CM, Fleet JC (2004) Vitamin D requirements: current and future. Am J Clin Nutr 80: 1735S-9S.
2. Lappe JM, Travers-Gustafson D, Davies KM, Recker RR, Heaney RP (2007) Vitamin D and calcium supplementation reduces cancer risk: results of a randomized trial. Am J Clin Nutr 85: 1586-1591.
3. Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Garland FC (2009) Vitamin D for cancer prevention: global perspective. Ann Epidemiol 19: 468-483.
4. Stechschulte SA, Kirsner RS, Federman DG (2009) Vitamin D: bone and beyond, rationale and recommendations for supplementation. Am J Med 122: 793-802.
5. Wallace AM, Gibson S, de la Hunty A, Lamberg-Allardt C, Ashwell M (2010) Measurement of 25-hydroxyvitamin D in the clinical laboratory: current procedures, performance characteristics and limitations. Steroids 75: 477-488.
6. Turpeinen U, Hohenthal U, Stenman UH (2003) Determination of 25-hydroxyvitamin D in serum by HPLC and immunoassay. Clin Chem 49: 1521-1524.

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