Dosage de la Vitamine B6 par HPLC

Définition

La Vitamine B6 désigne un groupe de composés chimiquement très similaires (Pyridoxine, Pyridoxal et Pyridoxamine) en interconversion dans les systèmes biologiques. La vitamine B6 fait partie du groupe de la Vitamine B, sa forme active, 5′-phosphate pyridoxal (PLP) joue un rôle important comme coenzyme dans de nombreuses réactions enzymatiques (environ 50) du métabolisme des acides aminés , du glucose et des lipides.

Structure

Synonymes :  Adermine; pyridoxine; Vitamine B6. 5-hydroxy-6-méthyl-3,4-pyridinediméthanol – C₈H₁₁NO₃ = 169,2 – Masse monoisotopique : 169.073898 Da – CAS-65-23-6

Hydrochlorure de pyridoxine

Noms de propriété. Aminoxine; Anacrodyne; Bécilan; Bedoxine; Beesix; Benadon; Bonasanit; Carthamex; Complément; Conductasa; Dermo 6; Heksavit; Hexobion; Lactosec; Memosprint; Metadoxil; Pyroxine; Surfoxyde; Vicotrat; Vita-B6; Xanturenasi.

C₈H₁₁NO₃, HCl = 205,6

Propriétés physico-chimiques

Poudre cristalline blanche ou sous forme de cristaux. P.f. 205 ° à 212 ° (température de décomposition).

Soluble: 1 volume dans 5 volumes d’eau et 1 volume dans environ 90 volumes d’éthanol; Pratiquement insoluble dans le chloroforme et l’éther; Peu soluble dans l’acétone.

Constance de dissociation. pKa 5,0 (-N), 9,0 (-OH), (à 25 °).

Coefficient de partage. Log P (octanol / eau), -0,8 (pyridoxine).

Test colorimétrique : Test de Mandelin’s: bleu → gris-vert.

Chromatographie sur couche mince (CCM): Système TA-Rf 59; Système TB-Rf 00; Système TC-Rf 08; Système TE-Rf 15; Système TL-Rf 05; Système TAE-Rf 75; Système TAF-Rf 67. (Solution de permanganate de potassium acidifiée, positive.)

Chromatographie liquide haute performance (HPLC): Système HAA Temps de rétention 2,9 min; Système HX-RI 65.

Spectre ultraviolet. Milieux acide aqueux-290 nm (A¹₁= 523a); Phosphate (pH 6,88) -254 nm (A¹₁= 219a), 324 nm (A¹₁= 426a).

Spectre infrarouge: Pics principaux aux numéros d’onde 1277, 1212, 1015, 1540, 870, 1086 cm ^-1  (chlorhydrate de pyridoxine, disque KBr). ^[2]M. David Osselton, Clarcke’s Analysis of Drugs and Poisons, 2004.

Spectre de masse: ions principaux à m / z 151, 94, 122, 106, 51, 53, 149, 150.

Quantification

La vitamine B6 peut être quantifiée par chromatographie liquide haute performance à détecteur UV: Dans le plasma ou les urines: pyridoxine, pyridoxal et acide 4-pyridoxique, la limite de détection est de 300 μg/L pour le plasma, 500 μg/L pour les urines.^[3]J. O’Reilly et al., J. Chromatogr., 1980, 183; Biomed. Appl., 9, 492-498.  Dans le plasma: Le 5′-phosphate pyridoxal , est détecté par fluorescence ^[4]N. Hirose et coll., J. Nutr. Sei. Vitaminol. (Tokyo), 1990, 36, 521-529. Dans le plasma: la limite de détection par fluorescence du 5′-phosphate pyridoxal est de 50 fmol- ^[5]S. Kurioka et al., Biomed. Chromatogr., 1993, 7, 162-165.

Cinétique : dans le corps, la Pyridoxine est absorbée depuis le tractus gastro-intestinal et convertie à la forme active, le phosphate de pyridoxal . Il est excrété dans l’urine, principalement sous forme d’acide 4-pyridoxique.

Liaison aux protéines: : dans le plasma, la pyridoxine ne se lie pas de manière significative aux protéines plasmatiques, cependant, le phosphate de pyridoxal est presque entièrement lié.

Dose : 20 à 200 mg de chlorhydrate de pyridoxine par jour.

Dosage par HPLC

L’analyse par HPLC (Chromatographie Liquide Haute performance) de la vitamine B6  permet de quantifier facilement (dosage) de la vitamine B6 de façon rapide et précise. Le kit « Eagle Bioscience » comprend tous les réactifs sous forme prête à l’emploi pour la préparation et l’extraction des échantillons à l’exception des colonnes (IC2100rp) et des étalons (IC2100ko). Les deux peuvent être fournis par Eagle Biosciences.

Principe

Pour la détermination de la vitamine B6 par HPLC, une étape de précipitation pour éliminer les substances de haut poids moléculaire est effectuée en premier. Après centrifugation, le surnageant est mélangé avec une solution de dérivatisation et incubé pendant 20 min à 60 ° C au bain marie. La sonde fluorescente est ensuite refroidie (2-8 ° C), centrifugée et injecté dans le système HPLC. La séparation isocratique par CLHP à 30°C dure 10 minutes. Les chromatogrammes sont enregistrés par un détecteur de fluorescence. La quantification est réalisée avec calibrateur de plasma délivré (le kit); La concentration est calculée par l’intégration des hauteurs de pics respectivement.

Matériel

Article no.	Composant	Désignation	Quantité
IC2100lm	ELU	Phase mobile	1000 ml
IC2100ka	CAL	Calibrant (lyophilisation de 4 mL)	1 vial
IC2100fr	PREC	Réactif précipitant	5 ml
IC2100rl	RECON	Solution de reconstitution	10 ml
IC2100dl	DERIVAT	Solution de dérivatisation (contient du KCN)	3 x 8.5 ml

Equipement

• Tubes de réaction de 1,5 ml (Eppendorf)
• Centrifugeuse
• Pipettes
• Appareil HPLC avec détecteur de fluorescence
• Colonne HPLC Vitamine B6 (IC2100rp)
• Chauffant Shaker ou bain marie
• Mélangeur Vortex

Préparation des réactifs

Reconstituer le calibrant (CAL) dans 4 ml de solution de reconstitution (RECON), diviser le Calibrant en plusieurs volumes et les stocker à -20 ° C. Éviter les cycles congélation/ décongélation répétés. La concentration de la vitamine B6 pourrait avoir des changements mineurs d’un lot à l’autre.

Tous les autres réactifs d’essai sont stables à 2-8 ° C, jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.

L’échantillon

Le plasma EDTA et le sérum pourraient être utilisés dans ce système d’essai. Pour la détermination de EDTA-sang total, un étalon de sang total et d’un réactif spécial adapté de précipitation sont disponibles.

La vitamine B6 est sensible à la lumière et à la température; Donc les échantillons doivent être protégés de la lumière et refroidis et centrifugés immédiatement.

Les échantillons sont stables dans l’obscurité à 2-8 ° C pendant 1 semaine. Pour les échantillons destinés au stockage plus longtemps, congeler à -20 ° C.

Traitement de l’échantillon

1. Pipeter dans des tubes de réaction de 1,5 ml:
200 μl d’échantillon, CAL ou CTRL
+
50 μl PREC
2. Bien mélanger. Laisser les tubes pendant 10 minutes à 2-8 ° C et centrifuger ensuite à 10.000g pendant 2 minutes.

3. Mélanger
100 μl de surnageant
+
250 μl DERIVAT
4. Incuber pendant 20 minutes à 60 ° C sur un agitateur ou dans un bain d’eau; Refroidir à 2-8 ° C et centrifuger à 10 000 g pendant 5 minutes
5. Injecter 20 μl du surnageant dans la boucle du système HPLC. le Le surnageant est stable dans l’obscurité pendant 5 jours à 2-8 ° C.

Paramètres chromatographiques

Matériau de la colonne	Bischoff Prontosil Eurobond, 5 μm
Dimensions de la colonne	125 mm x 4 mm
Débit	1-1,5 ml / min
Détection de fluorescence	Excitation à 320 nm
Emission	415 nm
Volume d’injection	20 μl
Durée	7 min (Patients en dialyse 15 minutes)
Température	30 ° C

Traitement de la colonne HPLC

Après l’analyse, la colonne doit être rincée avec 15 ml d’eau distillée (1 ml / min) et conditionnée par un mélange à 50%  methanol / eau distillée (environ 15 ml, débit 0,7 ml / min). Avant utilisation, le Système doit être équilibré avec env. 30 ml d’ELU.

Calculs

Linéarité : 500 ng/ml.

Limite de détection : 0.2 ng/ml.

Reproductibilité : 97.1 %.

Note

Afin de minimiser les interférences avec le sang total, le sang total doit être dilué 1: 1 avec de l’eau distillée. La concentration calculée doit ensuite être multipliée par 2.

Disposition

La solution de dérivatisation (DERIVAT) peut être oxydée avec du peroxyde d’hydrogène, après avoir ajusté le pH entre 6 et 8, elle peut être utilisée sous forme d’une solution saline aqueuse. La phase mobile (ELU) et la solution de précipitation (PREC) pourraient être neutralisées avec du NaOH et si la La valeur du pH est neutre, elle peut être éliminée comme solution saline. (Important: la réaction produira de la chaleur, Faites attention). Veuillez vous référer aux directives nationales appropriées.

Précautions

Tous les réactifs du kit de dosage HPLC pour la Vitamine B6 sont exclusivement destinés à la recherche et ne doivent pas être utilisés pour les procédures de diagnostic. Veuillez lire la documentation qui accompagne le Kit avant la manipulation.